Beclin1、p62和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌患者中的表達及意義

程新宇 周成美 孫潔 王露雪 王翠芳

(1沈陽醫學院附屬中心醫院病理科，遼寧 沈陽 110024；2錦州醫科大學)

自噬是細胞在生理狀態下適應環境的一種保護機制，自噬異常參與了腫瘤的發生、發展病理過程〔1〕。自噬相關蛋白(Beclin)1和自噬底物蛋白(p62)是自噬相關基因。Beclin1可與磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3C3或Vps34)形成自噬體，在調節自噬活性參與腫瘤發生發展中起重要作用〔2〕。p62是C-Myc編碼的一種多功能泛素化結合蛋白〔3〕，具有選擇性自噬功能，在一定程度上反映了自噬活性〔4〕；近年來隨著研究的不斷深入，研究者發現p62參與了自噬在內的眾多生命活動信號通路〔5〕，其表達和調控異常與多種惡性腫瘤密切相關〔6〕，增殖指數(Ki-67)是細胞增殖的重要標志，?？勺鳛轭A測惡性腫瘤發展及預后的指標。本文旨在探討乳腺浸潤性導管癌(IDC)及癌旁組織中Beclin1、p62和Ki-67表達差異及其與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2016年1月至2017年12月沈陽醫學院附屬中心醫院病理科79例IDC標本為觀察組，20例相應距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織標本為對照組，所有患者臨床病理資料存檔完整。年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑≤2 cm 26例，腫瘤直徑>2 cm 53例；組織學分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結轉移33例。所有患者經免疫組織化學檢測時未經放化療。

1.2試劑 通用型Beclin1和p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人單克隆抗體、鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP)試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3SP法免疫組織化學染色 所有IDC患者腫物切除后使用10%的中性甲醛溶液固定，依據病理規定規范取材，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規石蠟脫水，檸檬酸抗原(pH6.0)高壓修復，室溫冷卻30 min；用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4沖洗3次，每次3 min，用油筆圈定玻片上的待測組織區域；每張切片均按SP法操作流程制作(其中第一抗體Beclin1或p62稀釋比為1∶200；第一抗體Ki-67為即用型，均4℃冰箱冷藏過夜)；DAB顯色，鏡下觀察后自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗反藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標本切片作陽性對照。

1.4結果判讀 所有免疫組化切片由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法單獨判讀。Beclin1和p62陽性結果判讀標準：陽性表達為細胞質出現棕黃色顆粒。Ki-67陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞核。在高倍鏡下任意計數5個視野，每次選取200個細胞進行觀察，按陽性細胞所占百分比計分，評分標準為〔7〕:0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞<10%；2分為陽性細胞占10%～30%；3分為陽性細胞>30%。按染色強度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細胞百分比計分與染色強度計分的乘積≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman 等級相關分析。

2 結 果

2.1Beclin1、p62和Ki-67在IDC組織中表達 實驗組Beclin1陽性表達位于細胞質，呈棕紅色，陽性表達率〔44.3%(35/79)〕明顯低于對照組〔100%(20/20)，χ2=4.803,P=0.028〕；p62陽性表達位于細胞質，呈棕黃色，陽性表達率〔58.2%(46/79)〕明顯高于對照組〔10.0%(2/20)，χ2=6.532,P=0.011〕；實驗組Ki-67陽性表達位于細胞核，呈棕紅色，陽性表達率〔51.8%(41/79)〕明顯高于對照組〔5.0%(1/20)，χ2=7.389,P=0.007〕，見圖1。

2.2實驗組Beclin1、p62及Ki-67表達與臨床病理特征的關系 Beclin1、p62陽性表達在不同組織學分級、淋巴結轉移的IDC患者中差異有統計學意義(P<0.05)；Ki-67陽性表達在不同組織學分級的IDC患者中差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

圖1 IDC患者Beclin1、 p62、Ki67的表達(SP法，×100)

2.3實驗組Beclin1、 p62和Ki-67相關性分析 Beclin1和p62共同陽性表達14例，共同陰性表達12例，呈負相關(r=-0.330,P<0.01)；Beclin1和Ki-67共同陽性表達10例，共同陰性表達13例,呈負相關(r=-0.416,P<0.01)例；p62和Ki-67共同陽性表達30例，共同陰性表達22例，呈正相關(r=0.315,P<0.01)。

3 討 論

自噬相關蛋白表達失調可能是一種新的腫瘤發生機制〔8〕。Beclin1基因是哺乳動物中第一個被確認的自噬調控基因，在自噬過程中Beclin1能結合激活Vps34，形成Vps34-Beclin1復合體，對自噬泡的形成起關鍵調控作用，而Beclin1缺乏則嚴重影響自噬泡的形成〔9〕。Beclin1高表達能抑制腫瘤發展，失活則促進腫瘤發生〔10〕。本研究結果顯示Beclin1蛋白在IDC表達較癌旁正常乳腺組織明顯減低；且隨著組織學分級增加及淋巴結的轉移而Beclin1表達較少，提示自噬活性減低可能與IDC發生、發展有關。自噬相關蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發生時，p62首先與細胞質中泛素化蛋白結合，再與定位于自噬體內膜上微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)形成復合物，被自噬溶酶體降解。自噬過程中，p62蛋白在細胞質中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細胞質中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標記蛋白。雷程等〔11〕研究表明，p62蛋白在結腸癌組織細胞質中陽性表達明顯高于癌旁正常組織，p62高表達提示自噬活動減弱，促進腫瘤發展。劉婷婷等〔12〕研究發現p62在外陰鱗狀細胞癌的細胞質中表達明顯高于外陰正常皮膚，說明外陰鱗狀細胞癌自噬活動減弱促進了癌發生，與本實驗結果一致。本研究中p62異常聚集表明IDC自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細胞器和大分子物質得不到及時降解，導致活性氧大量產生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向IDC進一步轉化。

以往研究提示細胞內p62異常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信號〔13〕，反向調節自噬，起到促癌作用；近年來發現細胞內p62異常聚集，還可以激活核因子(NF)-κB和NF相關因子(Nrf)2兩個系統〔14〕。p62蛋白通過T6BD與腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6相互作用促進TRAF6的寡聚化，從而導致TRAF6的多聚泛素化及NF-κB活化〔15〕，NF-κB是一個轉錄因子蛋白家族，涉及細胞存活及分化，NF-κB信號途徑的激活對腫瘤細胞增殖及轉移非常重要；Nrf2是細胞內最重要的抗氧化應激調控通路穩定細胞內環境〔16〕。當氧化應急持續存在時，p62與Nrf2競爭結合腫瘤抑制因子(Keapl)，使Nrf2入核，從而激活Nrf2靶基因轉錄，此時激活Nrf2保護了腫瘤細胞免受氧化性損傷使癌細胞生存能力增強。本研究表明p62表達與腫瘤的惡性行為相關，其高表達預示IDC惡性程度高，易發生轉移，是預后差的指標。Burdelski等〔17〕使用免疫組化技術檢測了前列腺癌組織中p62的表達，發現其表達與組織學分級及淋巴結轉移有關，與本實驗結果相似。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是評價惡性腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標。本研究提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發生轉移，預后較差。

本研究提示隨著腫瘤惡性程度增加自噬相關基因表達異常，細胞增殖更加活躍促進了腫瘤發生，且Beclin1和p62 與淋巴結轉移相關，提示自噬相關基因表達異常能夠預示IDC侵襲力強，易發生轉移，預后差，自噬相關基因是判斷IDC預后的又一有效指標。