鎘對單環刺螠非特異性免疫及組織蓄積的影響

朱曉瑩，甘宏濤，孟霄，姚海洋，徐國成1,，徐加濤，劉統昊，曹黎鑫，許星鴻1,,*

1. 江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，淮海工學院，連云港 222005 2. 淮海工學院 海洋生命與水產學院，連云港 222005

重金屬鎘(Cd)是一種極易蓄積且半衰期長的有毒污染物，會對生物體的免疫和生殖系統造成損傷，還具有致癌、致畸等作用[1]。近年來隨著工農業生產的發展，水環境中的Cd污染程度也日益嚴重，不但會影響水生生物的生理機能，還會通過食物鏈富集對人體健康構成威脅。單環刺螠(Urechisunicinctus)分布于黃、渤海泥沙岸潮間帶及潮下帶，其富含必需氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素，提取物有一定抗腫瘤和提高免疫力的作用，具有較高的經濟價值和良好的開發利用前景[2]。目前對單環刺螠的研究主要集中于纖溶酶的分離純化和溶栓作用，以及對硫化物的應激代謝等方面[3-4]，而重金屬對單環刺螠的毒性報道很少，僅見唐永政等[5]檢測了3種重金屬離子(Cu2+、Hg2+、Cd2+)對幼螠的急性毒性。本文研究了單環刺螠在不同質量濃度Cd脅迫下，其免疫相關指標及組織中Cd蓄積量的變化規律，旨在探討Cd對單環刺螠的毒性效應，為養殖水質調控及海洋環境監測提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實驗用單環刺螠于2017年12月購自連云港市水產品市場，平均體長為(12.1±1.5) cm，平均體質量為(21.2±4.2) g，于實驗室暫養7 d后進行實驗。暫養條件為：鹽度25，pH 8，水溫(15±1) ℃，自然光照，連續充氣，日投喂1次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度104mL-1，投喂量10 mL·L-1，實驗所用海水均用曝氣自來水和海水晶配制，經檢測其Cd含量為0.001 mg·L-1，為實驗用海水本底。選擇大小相近、體表無損傷及活力強者用于實驗。

1.2 實驗設計

根據國家《漁業水質標準》(GB11607—1989)[6](Cd質量濃度≤0.005 mg·L-1)及海水中Cd通常的污染濃度[7]，本實驗Cd質量濃度設置為對照組0.005 mg·L-1、0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1，用氯化鎘(分析純，國藥集團藥業股份有限公司)配制的1 g·L-1原液調節各處理組Cd濃度。每組設3個平行，每個平行隨機放40條單環刺螠，于50 cm×60 cm×60 cm養殖箱中飼養，養殖條件與暫養時相同，每日定時換水1次，每次換水50%，并維持各組氯化鎘質量濃度。實驗期間不喂食，以消除餌料的影響。于處理0、3、6、12、24、48、72和96 h，每組隨機取3條單環刺螠，解剖取其血液，保留一部分全血用于測定血細胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，取上清液即血清，-80 ℃保存，用于測定免疫相關指標。于實驗5、10、15 d，每組取3條單環刺螠，解剖取其肌肉和消化道，-80 ℃保存，用于檢測組織中Cd蓄積量。

1.3 檢測方法

免疫相關指標選用血細胞密度(density of hemocyte, DHC)、血清總蛋白含量，酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、溶菌酶(lysozyme, LSZ)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力，過氧化氫(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。將抽取的一部分血液按1:1比例與檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose, ACD)抗凝劑充分混勻，用血球計數板(上海市求精生化試劑儀器有限公司，規格為16×25格)計數，然后按照文獻[8]計算血細胞密度。血清中總蛋白含量采用雙縮脲試劑法，以牛血清蛋白為標準，用T6紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)于540 nm進行比色測定[9]。PO和LSZ活力分別采用Ashida[10]、Hultmark等[11]方法進行測定。SOD活力、過氧化氫(H2O2)和MDA含量分別參照南京建成生物工程研究所的H2O2和MDA測試盒說明進行測定。取肌肉和消化道2種組織經濕法消化(V(HNO3)∶V(HClO4)=2∶1)，1% HNO3溶解，過濾，定容至25 mL，采用全譜直讀電感耦合等離子體原子發射光譜儀(美國Thermo fisher iCAP 6300型，檢出限為ppb級)測定Cd含量。

1.4 數據分析

實驗數據以“平均數±標準差”表示，采用SPSS18.0軟件進行單因子方差分析，LSD多重比較和Duncan檢驗，顯著水平設為0.05。

圖1 Cd脅迫對單環刺螠血細胞密度(DHC)和血清總蛋白含量的影響注：上標不同小寫字母的數值表示同一測試時間不同處理組間差異顯著(P<0.05，余同)。Fig. 1 Effect of Cd stress on the density of hemocyte (DHC) and the total protein content in serum of Urechis unicinctusNote: The values of different lowercase letters in the superscript indicate that the differences between the groups are significant at the same test time (P<0.05, the same below).

2 結果(Results)

2.1 Cd脅迫對單環刺螠血細胞密度和血清總蛋白含量的影響

如圖1所示，在Cd脅迫下，處理組血細胞密度(DHC)總體呈“先升后降再升”的趨勢。處理3 h，處理組DHC均顯著升高，以低濃度組DHC上升較快，在脅迫24 h時升至最大值。處理至96 h，處理組DHC均顯著高于對照組(P<0.05)，呈顯著的時間-劑量-效應關系(P<0.05)，而各實驗組總蛋白含量變化不顯著(P>0.05)。

2.2 Cd脅迫對單環刺螠血清中PO和LSZ活力的影響

從圖2可以看出，各處理組PO活力總體呈先升后降的趨勢。PO活力以較高脅迫濃度組(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)上升較快，于處理24 h且升高幅度較大。0.005 mg·L-1組于48 h達到最大值，隨后逐漸下降。至處理96 h，0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1兩組PO活力顯著低于對照組和0.005 mg·L-1組(P<0.05)；在實驗期間，隨脅迫時間延長，0.005 mg·L-1組PO活力沒有明顯時間-劑量-效應關系，而0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1兩組PO活力在3～24 h內與脅迫時間和Cd質量濃度顯著正相關(P<0.05)，在24～96 h內為顯著負相關(P<0.05)。

Cd脅迫下，LSZ活力呈先降后升再降的趨勢。處理3 h，各處理組LSZ活力均出現顯著下降，以較高脅迫濃度組(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)下降幅度較大，于處理6 h出現明顯回升。隨著脅迫時間延長，處理組LSZ活力在回升后又呈下降趨勢。處理72 h后，各處理組LSZ活力均顯著低于對照組(P<0.05)，在實驗期間，各處理組LSZ活力有波動，沒有明顯的時間-劑量-效應關系。

2.3 Cd脅迫對單環刺螠血清中SOD活力的影響

Cd脅迫對單環刺螠血清中SOD活力的影響如圖3所示。隨脅迫時間延長，各處理組SOD活力總體呈緩慢上升趨勢，除處理3 h的0.005 mg·L-1組以外，其他各處理組SOD活力均高于對照組，且在實驗期間，SOD活力與脅迫時間呈顯著的時間-效應關系(P<0.05)，而與Cd質量濃度沒有顯著的劑量-效應關系(P>0.05)。

圖2 Cd脅迫對單環刺螠血清中酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活力的影響Fig. 2 Effect of cadmium stress on the activity of phenoloxidase (PO) and lysozyme (LSZ) in serum of Urechis unicinctus

圖3 Cd脅迫對單環刺螠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響Fig. 3 Effect of cadmium stress on the activity of superoxide dismutase (SOD) in serum of Urechis unicinctus

圖4 Cd脅迫對單環刺螠血清中H2O2和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 4 Effect of cadmium stress on the content of H2O2 and malondialdehyde (MDA) in serum of Urechis unicinctus

2.4 Cd脅迫對單環刺螠血清中H2O2和MDA含量的影響

由圖4可見，各處理組H2O2含量呈先升后降再升的趨勢。H2O2含量于暴露6 h升到最大值，且存在顯著的劑量-時間-效應關系；隨后又快速下降，于12 h降至最低，均低于對照組，隨后又逐漸上升。至96 h時，各處理組H2O2含量均高于對照組。Cd脅迫下，處理組MDA含量總體呈緩慢上升趨勢，至96 h，各處理組MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，且在3～6 h內，MDA含量與脅迫時間和Cd質量濃度顯著正相關(P<0.05)，在72～96 h則顯著負相關(P<0.05)。

2.5 Cd脅迫對單環刺螠組織蓄積的影響

如圖5所示，隨Cd暴露時間延長，各處理組單環刺螠體壁肌肉和消化道中Cd含量均呈上升趨勢，且存在顯著的劑量-濃度效應關系(P<0.05)。Cd在單環刺螠機體的蓄積具有組織特異性，消化道中的蓄積量顯著多于體壁肌肉(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 Cd脅迫對單環刺螠非特異性免疫的影響

有研究表明環境變化會對血細胞數量產生顯著影響，水生動物DHC常作為生物體免疫狀態的衡量指標[12]。擬穴青蟹(Scyllaparamamo)在不同濃度(0.0025、0.05、0.075和0.1 mg·L-1) Cd脅迫后，短時間內DHC顯著降低，表現出劑量-效應關系，脅迫至9 d后，較低濃度(0.0025和0.05 mg·L-1)處理組DHC恢復至對照組水平[13]。長臂蝦(Palaemonelegans)經Cd暴露后8 h，其DHC顯著下降，而后又逐漸升高[14]。本研究中，Cd脅迫96 h后，單環刺螠DHC各處理組均顯著高于對照組，且存在一定的劑量-效應關系，與上述研究結果相近。表明生物體對Cd脅迫具有一定的適應性，在脅迫濃度較低時，對機體的毒害作用較小，較高脅迫濃度則會引起明顯的應激反應，DHC顯著變化，而且不同水生動物對Cd脅迫的響應存在差異。

Zahedi等[15]將波斯鱘(Acipenserpersicus)幼體暴露于0.68 mg·L-1的Cd中14 d，魚體血清總蛋白含量無顯著變化；將鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)置于0.01 mg·L-1的Cd中脅迫96 h，其血清總蛋白含量變化不明顯[16]，與本研究結果一致，表明Cd脅迫對機體血清總蛋白含量可能影響不大。

PO是水生無脊椎動物非特異性免疫防御系統中的重要成員[17]。秦圣娟等[18]報道，隨著Cd濃度增大，長江華溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)血清中PO活力總體呈現先升后降的變化趨勢，與本研究結果一致。表明PO對金屬離子較為敏感，在機體受到環境中重金屬離子的脅迫時，免疫系統中PO被誘導產生，以防御外界環境脅迫對機體的損傷。而在長時間的較高濃度Cd脅迫下，免疫機能受到影響，所以出現隨暴露時間延長，PO活力逐漸下降的現象。

圖5 Cd脅迫對單環刺螠肌肉和消化道中Cd蓄積量的影響Fig. 5 Effects of cadmium stress on the cadmium accumulation of the muscle and the digestive tract of Urechis unicinctus

LSZ是體液免疫中重要成分之一，Cd會和溶菌酶的活性位點直接結合，改變其結構和功能，且不同濃度的Cd與溶菌酶的結合能力不同，因而對酶活性也會有不同程度的影響[19]。李慧等[20]研究發現0.05和0.5 mg·L-1的Cd可引起鯉魚(Cyprinuscarpio)血清中LSZ活力顯著升高；王志和武二栓[21]研究表明鯉魚血清中LSZ含量隨Cd濃度增加而升高，且高濃度組顯著高于對照組。本研究中，單環刺螠LSZ活力在Cd脅迫下總體呈先升后降的趨勢，至脅迫72 h后，各處理組LSZ活力均顯著低于對照組，表明Cd脅迫對單環刺螠的抗菌能力影響較大，不同生物體應對Cd脅迫的免疫機制亦不同。

3.2 Cd脅迫對單環刺螠抗氧化能力的影響

正常情況下，生物體內產生的H2O2等成分會被抗氧化系統中相關酶清除，維持機體正常的生命活動，而當機體受到環境因子脅迫時，其含量會發生變化。研究表明，Cd會抑制機體內抗氧化相關酶的活性，促使H2O2含量增加，誘發氧化損傷、細胞凋亡等過程[26]。Wang等[27]研究表明淡水蟹(Sinopotamonhenanense)在暴露于濃度為58 mg·L-1的Cd后，與對照組相比，鰓中H2O2含量在2～4 h顯著增加，8 h后逐漸下降，處理24～48 h后再次增加。薛蓓等[28]發現脊尾白蝦(Palaemoncarincauda)暴露于Cd后，0.005 mmol·L-1組在短時間內H2O2含量變化比其他處理組更明顯，脅迫至24 h后，各實驗組與對照組均不存在顯著性差異。本研究中，各處理組H2O2含量于6 h時達到最大值，且差異顯著；隨后快速下降，于12 h降至最低，均低于對照組；96 h時，各處理組H2O2含量均高于對照組，且各處理組間差異不顯著。表明單環刺螠在受到Cd短期脅迫后，其體內產生的大量H2O2得不到及時清除而積聚在體內，致使其含量迅速上升，Cd濃度越高，單環刺螠體內的H2O2含量相對越高；而隨脅迫時間延長，各處理組的H2O2含量逐漸下降，是由于機體受到Cd脅迫后誘導體內的抗氧化系統產生相關酶，使體內過剩的H2O2被及時清除。

MDA是由自由基與生物膜中的脂類形成的過氧化產物，可通過MDA的含量反映膜脂過氧化程度及膜系統的受損程度。0.005 mmol·L-1濃度的Cd暴露后，脊尾白蝦MDA含量快速上升，于9 h時達到最大值，且顯著高于對照組及其他各處理組，隨后又逐漸下降，而較低濃度(0.001和0.002 mmol·L-1)組MDA的含量變化則相對緩慢[28]。本研究中，0.005和0.05 mg·L-1濃度組MDA含量總體呈緩慢上升趨勢，而0.5 mg·L-1濃度組則先升高后降低。這與上述研究結果相似。這可能是單環刺螠在短時間內受到較高濃度Cd脅迫后，機體內產生過多的自由基成分未及時清除而使脂質過氧化過程加劇，MDA含量增加；隨脅迫時間的延長，單環刺螠體內誘導產生了抗氧化相關酶，清除了機體內過剩的自由基成分，MDA含量相應下降。

綜上所述，Cd脅迫會刺激機體產生自由基和H2O2等成分，進入體內的Cd首先可能通過誘導合成大量非特異性免疫機制中的PO、LSZ等一些酶類以及金屬硫蛋白基因的大量表達，進行結合進入體內多余的Cd2+，起到暫時解毒的作用，其次會誘導抗氧化機制中的SOD等抗氧化酶成分，用于清除體內過剩的氧自由基、H2O2等成分，H2O2含量則會快速下降；當脅迫時間過長時，體內進入過多的Cd，超出了免疫系統中的酶類可以結合的上限，多余的Cd會持續刺激機體產生大量氧自由基、H2O2等成分，與生物膜中的脂類形成的過氧化產物MDA，故MDA會持續增加。因此MDA含量可作為單環刺螠在Cd環境中長期脅迫后的免疫檢測指標。

3.3 Cd脅迫對單環刺螠組織蓄積的影響

相關研究表明，水生生物對重金屬Cd的蓄積具有組織特異性[29-30]。于淑池等[31]報道波紋巴非蛤(Paphiaundulata)于安全濃度下(0.02767 mg·L-1)下脅迫120 h，其體內Cd的蓄積量水平依次為內臟團>鰓>肌肉；Charan-Dixon等[32]用質量濃度分別為15 μg·L-1、765 μg·L-1的Cd脅迫海參(Australostichopusmollis)，結果表明其呼吸腸中Cd的蓄積量高于體壁肌肉；張林寶等[25]研究表明菲律賓蛤仔肝胰腺與鰓的Cd蓄積量隨Cd濃度與暴露時間的增加而增大。本實驗中，單環刺螠用不同質量濃度(0.005、0.05和0.5 mg·L-1)的Cd脅迫5 d、10 d、15 d后，其消化道Cd的蓄積量顯著高于肌肉，且呈現明顯的濃度效應和時間效應，與上述報道的結果一致。這可能是因為單環刺螠不同組織對重金屬的吸收、代謝及調節能力不同，可直接通過攝食經消化道吸收水體或殘留在餌料中的重金屬，因而消化道內Cd含量高于肌肉。