60Co-γ射線對不同品種澳洲堅果萌動種子的誘變效應

柳 覲，倪書邦，孔廣紅，吳 超，賀熙勇

(云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100)

【研究意義】澳洲堅果(Macadamiaspp.)又名昆士蘭栗、澳洲胡桃，為山龍眼科(Proteaceae)澳洲堅果屬(Macadamia)常綠喬木，原產于澳大利亞，但大規模商業化種植始于夏威夷，因此又稱夏威夷果，其大規模種植歷史僅有數十年，是一種新興的高檔堅果。澳洲堅果果仁口感酥脆，富含多種不飽和脂肪酸和人體必需的氨基酸、微量元素和維生素[1-2]，長期食用有助于降低心血管疾病的發生率[3-4]。目前澳洲堅果種植范圍包括美國、澳大利亞、肯尼亞、南非、中國、東南亞等國家和區域，中國自20世紀70年代末開始澳洲堅果的引種試種，現已成為世界上澳洲堅果種植面積最大的國家，而云南省則是中國澳洲堅果的主產區[5]。當前云南省推廣種植的澳洲堅果品種均從國外引進，由于品種選育地與云南種植區的氣候環境差別較大，致使大多數品種的產量等田間表現遠不及其原始選育地[6-7]，并且近年國外引種愈加困難，優良品種的匱乏已嚴重制約了中國澳洲堅果產業的發展，因此，必須培育出適合中國種植環境的澳洲堅果優良品種。因為澳洲堅果是外來物種，國內沒有多樣化的野生種質資源可供選種利用。因此，利用人工誘變方式增加現有種質資源的變異率，得到具有某種優異性狀的突變體植株，進而將其選育成為產量、品質或抗性表現較好品種，是澳洲堅果品種選育的一個有效途徑。目前常用的誘變方式主要包括EMS誘導[8]、離子注入[9]、磁場處理[10]、太空誘變[11]和γ射線輻照等，其中60Co-γ射線輻照誘變應用最為廣泛，在諸多糧食作物和園藝作物上應用并取得了一系列成效?！厩叭搜芯窟M展】在澳洲堅果輻照萌動種子誘變育種方面，國內外尚未見報道。近年來本研究組以澳洲堅果干種子[12]、接穗[13]等為誘變材料，采用60Co-γ射線輻照的方式開展了誘變育種，并對不同試驗材料的誘變效應進行了較為系統的研究?！颈狙芯壳腥朦c】但萌動種子與干種子不同，萌動種子的胚組織有絲分裂旺盛，細胞內進行著大量的遺傳物質的復制，對60Co-γ射線輻照更敏感，基因突變的頻率也更高。以澳洲堅果主栽品種云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的萌動種子為材料，采用不同劑量60Co-γ輻照的方式進行誘變處理，對誘變后代的萌發和生長情況進行了觀測，以期建立澳洲堅果60Co-γ的輻照誘變育種的系統方法?！緮M解決的關鍵問題】探明不同品種對60Co-γ的輻照誘變的致死劑量和半致死劑量，創制出遺傳意義上全新的澳洲堅果新種質，豐富澳洲堅果種質資源，為新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集云澳57、云澳51、云澳41、云澳58共4個澳洲堅果品種的成熟種子，人工脫皮后將殼果置于經多菌靈滅菌后的沙床催芽，每天灑水2次以保持沙床濕潤。播種1周后將上部的細沙小心刨去，將殼果灑水沖洗后挑出果殼開裂1 mm以上但芽點尚未突出果殼的萌動種子作為實驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.160Co-γ射線輻照及致死劑量確定 將上述萌動種子用劑量為10、25、40、55、70、85、100、115、130的60Co-γ射線進行輻照處理，劑量率為10 Gy/h，每個劑量3次重復，以同一批催芽裂殼但未經輻照的萌動種子為對照。將輻照后的萌動種子繼續置于沙床催芽，每周調查發芽率1次，通過與對照比較，確定不同品種萌動種子的致死劑量和半致死劑量。

1.2.2 誘變苗觀測及突變體種質篩選 對經不同劑量60Co-γ射線輻照后誘變苗的葉長、葉寬、莖長、莖粗等性狀參數進行測定。待第2輪真葉長定后，將誘變苗移栽至營養袋，待苗高60 cm進行大田定植并持續跟蹤觀測，定植株行距為2 m×4 m，每年觀測2次，重點觀測莖干生長量、樹形、葉形、分枝和開花情況。

1.3 統計方法

試驗數據采用SPSS16.0軟件進行統計分析；采用Microsoft Office Excel 2013軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ射線輻照對不同品種澳洲堅果萌動種子發芽的影響

對供試4個品種的萌動種子經不同劑量60Co-γ射線輻照后的發芽勢和發芽率進行調查發現(圖1～4)，60Co-γ射線輻照對各品種澳洲堅果萌動種子的發芽勢均有明顯的抑制效應。輻照劑量越高，萌動種子的發芽時間越晚、發芽速率越慢、發芽率越低。以品種云澳57為例，對照和經10、25 Gy處理后的萌動種子從第2周開始發芽；經40 Gy處理后從第3周開始發芽；經55、70、85 Gy處理后從第4周開始發芽；經100 Gy處理后從第5周開始發芽；經115 Gy處理后從第6周開始發芽；經130 Gy處理后的萌動種子則沒有發芽。品種云澳41無論是否是輻照后的萌動種子，發芽時間均要比其他3個品種晚。

2.2 60Co-γ射線輻照對不同品種的致死劑量和半致死劑量

發芽率調查發現，各品種未經輻照的萌動種子在第6～8周均已全部發芽或發芽率已穩定；8周后將沙床中未發芽的萌動種子刨出觀測發現，所有未發芽種子的芽點已變褐甚至腐爛，已無后續發芽可能；因此以輻照后第8周的發芽率代表各處理的最終發芽率，對不同品種經不同劑量60Co-γ射線輻照后的發芽率進行了回歸分析，如圖5～8所示。

供試品種云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的輻照劑量(x，Gy)與發芽率(y， %)間的回歸關系分別為：y=0.0011x2- 0.9727x+106.26(R2=0.9839)；y=-0.0024x2-0.4576x+103.50(R2=0.9884)；y=-0.0051x2-0.2233x+101.70(R2=0.9281)；y=0.0012x2-1.0402x+105.89(R2=0.9678)。由此回歸方程推算，云澳57、云澳51、云澳41、云澳58對劑量率為10 Gy的60Co-γ射線輻照的半致死劑量分別為62.22、81.81、81.14、57.55 Gy，致死劑量分別為127.67、133.17、121.01、117.81 Gy，說明不同品種澳洲堅果萌動種子對60Co-γ射線輻照的敏感性存在差異，其中以云澳51最耐受，而云澳58最敏感。

圖1 60Co-γ射線輻照對云澳57萌動種子發芽的影響Fig.1 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 57

圖2 60Co-γ射線輻照對云澳51萌動種子發芽的影響Fig.2 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 51

圖3 60Co-γ射線輻照對云澳41萌動種子發芽的影響Fig.3 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 41

2.3 60Co-γ射線輻照萌動種子對幼苗形態的影響

對不同品種萌動種子經60Co-γ射線誘變處理后幼苗的形態觀測發現，隨著輻照劑量的增高，植株的變異率也明顯增大。與對照相比，幾乎所有經輻照的誘變苗都出現了植株矮化和莖干增粗的現象，究其原因與60Co-γ射線輻照使萌動種子的芽點受到抑制有關。以品種云澳57為例，最為常見的變異現象是分叉增多，一粒萌動種子或出現雙根、或出現雙莖、甚至同時出現雙根和雙莖(圖9-A)；部分誘變苗表現出須根減少(圖9-B)，或主根變短須根增多的現象(圖9-C)。

圖4 60Co-γ射線輻照對云澳58萌動種子發芽的影響Fig.4 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 58

圖5 品種云澳57萌動種子發芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.5 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 57 and irradiation dose of 60Co-γ

圖6 品種云澳51萌動種子發芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.6 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 51 and irradiation dose of 60Co-γ

圖7 品種云澳41萌動種子發芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.7 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 41 and irradiation dose of 60Co-γ

圖8 品種云澳58萌動種子發芽率與60Co-γ射線輻照劑量的回歸分析Fig.8 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 58 and irradiation dose of 60Co-γ

3 討 論

誘變育種是拓寬澳洲堅果種質資源遺傳基礎、提高種質資源遺傳多樣性，創制新種質的重要手段。采用澳洲堅果萌動種子作為誘變材料，萌動種子中的細胞有絲分裂旺盛、遺傳物質的復制和轉錄非?；钴S，遺傳物質更易受到射線輻照的影響發生突變。與前期研究相比[12]，同一品種萌動種子的致死劑量、半致死劑量明顯小于干種子，說明其對60Co-γ射線輻照更為敏感，更易于獲得突變體植株。

經10和25 Gy的低劑量60Co-γ射線輻照后，品種云澳57、云澳51和云澳41在部分時間段的發芽率甚至要高于對照(CK)，這與前人的研究相一致。此外，無論是否經過輻照，品種云澳41開始發芽的時間均要比其他3個品種晚，發芽率前期增長較慢，5周后才開始快速增長，究其原因與其品種特性有關。不同品種萌動種子對60Co-γ射線輻照的耐受性不同，4個供試品種的耐受性依次為云澳51>云澳41>云澳57>云澳58。

A：出現雙根、或出現雙莖、或同時出現雙根和雙莖；B：須根減少；C：主根變短須根增多A: One seedling with double root, or double stem, and double root and double stem at the same time; B: Decrease of the fibrous root; C: Shorter taproot with the increase of fibrous root圖9 云澳57的幼苗變異情況Fig.9 The seedling mutant of macadamia cultivar YunMac 57

半致死劑量(Lethal Dose 50，LD50)是作物誘變育種的重要參數，多數研究者認為，半致死劑量可作為作物誘變育種的最適宜誘變劑量。經半致死劑量誘變處理后，既能保證一定數量的成活率，又可達到較高的誘變幾率。經不同品種間的比對和重復試驗，發現澳洲堅果萌動種子的半致死劑量為57.55～81.81 Gy，這提示在后續的以萌動種子為材料的60Co-γ射線誘變育種實踐中，可參照此區間的輻照劑量進行誘變處理。

通過研究，已初步篩選出了一批在形態性狀上與對照有明顯差異的疑似突變體植株，并在大田中進行了定植和跟蹤觀測，但其開花、結果等農藝性狀還有待研究。

4 結 論

澳洲堅果不同品種萌動種子對60Co-γ射線輻照的耐受性不同，澳洲堅果萌動種子的60Co-γ射線適宜誘變劑量為57.55～81.81 Gy。