鼠李糖乳桿菌GG株對鉛中毒子代鼠的保護作用

冷星宇 俞勤斐 周凡 沈薇 孟曉靜 吳嫻波 覃旻 范宏英

1南方醫科大學公共衛生學院（廣州510515）；2畢節市第三人民醫院（貴州畢節551500）；3南方醫科大學南方醫院新生兒科（廣州510515）

鉛是一種廣泛存在于生活環境和職業環境中的有毒重金屬［1］，可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進入機體內，損傷神經、造血、消化道和生殖等多個系統［2-6］。而長期暴露于高鉛環境，將嚴重影響人體健康，尤其對兒童的神經系統的影響更為顯著［7］。發育期鉛神經毒性的突出特點是鉛暴露可通過胎盤和血腦屏障，影響海馬突觸功能，導致學習記憶和認知功能下降［8］。目前，對于鉛中毒的治療多采用金屬絡合劑，如依地酸二鈉鈣、2，3-二巰基丁二酸，研究證明，金屬絡合劑會產生持續的胃腸道不良反應、“過絡合綜合征”、肝腎毒性等毒副作用，并且不適用于孕婦、哺乳期婦女及兒童［9-11］。因此，需要尋找新的方法或制劑防治這類人群的鉛中毒。

近年來，利用微生物吸附環境中有毒、有害物質被廣泛關注并初具成效［12-13］。受此啟發，國內外專家著力開發腸道益生菌吸附重金屬的潛能。人體腸道益生菌主要包括乳桿菌、雙歧桿菌與部分革蘭陽性球菌等，具有維持腸道穩態、調節免疫功能、抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能［14-15］。GIRI等［16］報道對鉛暴露的鯉魚給予來源人腸道的羅伊氏乳桿菌P16（Lactobacillus reuteri P16）干預，可以減少鉛在魚體內的蓄積，同時可改善鉛所致的造血功能紊亂。此外，一項對坦桑尼亞地區的孕婦和兒童的干預研究表明，食用益生菌L.rhamnosus GR-1 發酵的酸奶可降低孕婦體內的汞和砷等有毒重金屬的水平，首次證明乳酸菌能降低人血液中重金屬濃度［17］。

鼠李糖乳桿菌GG株（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是一株從人類腸道分離的乳桿菌，具有腸道黏附率高，定植力強，能降低體內膽固醇水平、調節免疫功能等益生功能［18］。但目前還沒有發現LGG 能否在防治鉛中毒中發揮作用，為此，本研究通過建立孕期及哺乳期鉛暴露模型，研究LGG 對仔鼠血液、大腦、骨骼及腎臟中的鉛蓄積的影響，并觀察LGG 對鉛導致的肝臟氧化、腦部和腸道病理損傷的保護作用，對防治發育期幼兒鉛中毒，促進我國兒童健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基LGG（ATCC53103）由美國南加州大學黃勝和教授饋贈。37 ℃培養于MRS 培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.2 主要試劑醋酸鉛為分析純，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）等檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物實驗6 周齡SPF 級C57BL/6 鼠24 只，其中雄鼠、雌鼠各12 只，購于廣東省醫學實驗動物中心（許可證號：SCXK（粵）2013-0002）。適應性喂養1 周（室溫維持在22～25 ℃，晝夜循環為12 h，普通喂養，飲用無菌水），按雌雄比1∶1 將小鼠隨機分為4 組，動物實驗分組及處理方法見表1。

表1 動物實驗分組及處理Tab.1 Animal experimental protocol

待雌鼠懷孕后，分籠喂養，各組處理方法不變，直至實驗結束。記錄各仔鼠出生時間，21日齡時，0.5%戊巴比妥鈉50 mg/100 g 體質量麻醉處死，收集全血、胸骨、左股骨、腎、肝、腸和腦，所有樣本保存于固定液或-20 ℃冰箱。本研究獲得南方醫科大學動物倫理委員會批準及監督，整個研究過程符合動物倫理學要求（倫理批準文號：L2015029）。

1.4 體質量及臟器系數測量仔鼠處死前，稱量并記錄各仔鼠體質量。腦、肝、腎等臟器取樣后，吸水紙吸干臟器表面水分，稱重，計算臟器系數：臟器指數=器官濕重（mg）/體質量（g）。

1.5 組織鉛含量測定血鉛測定：10 μL 全血稀釋于990 μL 血液稀釋液（0.1%Triton-×100、1%濃硝酸用去離子水稀釋），震蕩30 s，電感耦合等離子體質譜（ICP_MS）法檢測鉛濃度。檢測分析條件為：等離子體流15 L/min，霧化氣流速0.8 L/min，輔助氣流速0.2 L/min，RF 功率1 100 W，等離子體觀測方向為軸向，進樣流速1.5 mL/min。

組織鉛測定：骨、腦、腎組織80 ℃烘烤4 h，精確稱取0.05 g；加3 mL 濃硝酸，2 mL 過氧化氫微波消解，設置消解程序（升溫1∶1 200 W，5 min，120 ℃維持3 min；升溫2∶1 200 W，5 min，150 ℃維持5 min；消化：1 200 W，3 min，180 ℃維持10 min；降溫：15 min）［22］。消解后，去離子水定容至50 mL，同上ICP_MS 法測鉛濃度：組織鉛濃度（μg/g）=樣本鉛液濃度×50/組織重量。

1.6 氧化應激因子檢測稱取肝臟1.0 g，加入生理鹽水9.0 mL，冰上研磨制成10%的組織勻漿，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液。BCA 蛋白濃度檢測試劑盒檢測各樣本蛋白濃度，按GSH-Px、SOD、NO等試劑盒說明書檢測各氧化應激因子活力。

1.7 小腸、腦組織病理切片取小腸及腦組織于10%多聚甲醛固定2 d，脫水、石蠟包埋后切制成5 μm的切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察小腸及腦的病理變化。

1.8 統計學方法應用SPSS 19.0 軟件進行數據處理，各組數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析法對結果進行處理，方差齊時，采用LSD法進行兩兩比較；方差不齊時，采用SNK 法進行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子代鼠體質量、臟器系數測定子代鼠體質量及臟器系數，結果顯示（圖1），Pb 組子代鼠體質量與肝、腦的臟器系數均低于NC 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），腎的臟器系數高于NC 組（P＜0.05）；與Pb 組相比，LGG.Pb 組的體質量、肝、腦的臟器系數升高（P＜0.05），說明LGG 干預鉛暴露母鼠可改善子代鼠體質量減輕及鉛對肝、腦等重要器官的綜合損傷作用。

2.2 子代鼠各組織鉛濃度檢測子代鼠血鉛、腦鉛、骨鉛和腎鉛濃度，結果顯示（圖2），與NC 組相比，Pb 組子代鼠的血鉛、腦鉛、骨鉛、腎鉛濃度均顯著升高（P＜0.05）；LGG.Pb 組子代鼠的血鉛、腦鉛、骨鉛、腎鉛濃度降低（P＜0.05），說明LGG 干預鉛暴露母鼠可減少鉛在子代鼠血、腦、骨和腎等組織器官的蓄積。

圖1 各組子代鼠體質量與重要臟器系數Fig.1 The weight and the organ coefficient of offspring

圖2 各組子代鼠組織器官鉛濃度Fig.2 The concentration of Pb in offspring′s tissues or organs

2.3 肝臟氧化應激相關因子活性檢測子代鼠肝臟氧化應激水平，結果顯示（圖3），與NC 組相比，Pb 組子代鼠肝臟中GSH、GSH-Px、SOD等活性降低、NO 水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與Pb 組相比，LGG.Pb 組子代鼠GSH、GSH-Px 及SOD 活性升高（P＜0.05），而NO 水平降低（P＜0.05）。說明LGG 干預鉛暴露母鼠可增強子代鼠肝臟的抗氧化酶活性，降低鉛所致的氧化應激分子水平，以減輕鉛中毒所致的氧化應激損傷。

2.4 腸組織病理結果對子代鼠小腸進行HE 染色，結果顯示（圖4），Pb 組子代鼠小腸病理損傷嚴重，腸上皮細胞的標志性空泡消失、排列疏松，胞核移動至胞質中間，無極性；杯狀細胞體積變小、數量減少；小腸腺萎縮；中央乳糜管變窄甚至消失。LGG.Pb 組小腸的病理損傷減輕，腸上皮細胞排列緊密，胞核極性正常；杯狀細胞及中央乳糜管形態恢復正常。提示LGG 干預后，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠的小腸病理損傷得到有效改善。

圖3 各組子代鼠肝臟氧化應激相關因子活性Fig.3 The activities of oxidative stress related factors in offspring′s liver

圖4 各組子代鼠小腸的HE 染色（×200）Fig.4 The HE staining of offspring′s small intestine（×200）

2.5 腦組織病理結果對子代鼠腦組織進行HE染色，結果顯示（圖5），Pb 組子代鼠大腦皮層有明顯的病理損傷：出現彌漫性神經元固縮、星形膠質細胞增生水腫等病理損傷，并有不同程度的神經元壞死現象。LGG.Pb 組的病理損傷有所恢復，大腦皮層細胞排列緊密，小膠質細胞和星形膠質細胞增生、水腫情況明顯減少，少有神經元細胞壞死。說明，LGG 干預鉛暴露母鼠可緩解子代鼠大腦皮層的病理損傷。

圖5 各組子代鼠大腦的HE 染色（×100，×400）Fig.5 The HE staining of offspring′s brain（×100，×400）

3 討論

鉛是一種穩定的重金屬，由于其特殊的理化性質，廣泛應用于現代工業，同時也是大部分化妝品、日用品不可缺少的成分［2，4］。人們通過各種途徑接觸鉛，經口攝入并由胃腸道暴露鉛是目前生活環境中慢性鉛中毒的主要途徑之一［23］。大量研究表明，鉛可引起人體多個系統損傷并造成遠期影響，但孕期至哺乳期婦女暴露鉛會引起嬰兒何種變化至今鮮有報道［24］。本研究發現，母鼠經飲水進行鉛暴露，子代鼠的大腦、骨骼和腎臟等重要組織的鉛水平均升高，且血鉛水平達到600 μg/L以上（圖1），說明孕期及哺乳期母鼠鉛暴露可導致子代小鼠發生鉛中毒。

益生菌能定植于人體腸道并產生確切的健康效益，借鑒利用微生物吸附環境有害物質的經驗［12-13］，國內外研究人員廣泛關注其吸附重金屬的潛能，TEEMU等［21］發現，鼠李糖乳桿菌GG 具有吸附污水中鉛、鎘、汞等有毒重金屬的能力。本研究在上述動物模型基礎上，使用109CFU的LGG 對母鼠進行灌胃干預，探討LGG 對母鼠暴露鉛致子代鼠鉛中毒的保護作用，結果顯示，經LGG 干預鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠體質量及肝、腦的臟器指數升高（圖1），血鉛、腦鉛、骨鉛和腎鉛等組織鉛濃度降低（圖2），表明LGG 干預鉛暴露母鼠能通過降低鉛在子代鼠體內的蓄積量來減輕鉛對子代鼠的綜合毒性。

研究報道，鉛進入機體后通過與GSH、GSHPx、SOD等酶分子中-SH 及其活性中心金屬離子作用，使這些抗氧化酶的活力下降［19］。與既往研究相同，本研究結果顯示鉛中毒子代鼠肝臟內抗氧化酶GSH、GSH-Px、SOD的活性降低，NO的水平升高（圖3）。但經LGG 干預鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠肝臟抗氧化酶的活性恢復甚至有所提高，同時NO 活性降低，提示LGG 對鉛致子代鼠肝臟的氧化損傷有抑制作用，從而保護子代鼠肝臟的健康。MAJLESI等［25］將L.plantarum CNR273和B.coagulans 用于汞中毒小鼠模型，也得到相同結果，即小鼠血液及肝、腎等靶器官的汞蓄積量減少，且汞導致的氧化應激損傷減輕。此外，經口攝入是鉛主要的暴露途徑，胃腸道是鉛進入機體的第一道防線［1］。本研究病理結果顯示，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠的小腸出現絨毛空泡消失、小腸腺萎縮等病理損傷（圖4）。有研究指出，經消化道暴露鉛會使腸屏障受到破壞，同時血腦屏障也會被損傷，進而引發神經性相關疾?。?6］。大腦是鉛的重要的靶器官，血鉛水平與鉛在腦的蓄積量緊密相關，而鉛在腦的蓄積量決定了腦損傷的嚴重程度［27］。本研究發現，母鼠鉛暴露致鉛中毒子代鼠大腦發生以神經元萎縮、死亡為主的病理變化。經LGG 干預鉛暴露母鼠后，鉛中毒子代鼠小腸和大腦皮層的病理損傷得到有效的改善，表明LGG 干預母鼠能保護子代鼠小腸和大腦正常的生理結構免受鉛的破壞。

綜上，孕期及哺乳期母鼠鉛暴露后可引起子代鼠鉛中毒，使用LGG 干預鉛暴露母鼠可減少鉛在子代小鼠血液、骨骼、腦及腎臟中的蓄積，同時增強肝臟的抗氧化酶活力，并改善鉛致小腸及腦的病理損傷，本研究為防治孕期及哺乳期鉛暴露引起的子代鉛中毒提供了一個新思路。LGG 防治母鼠暴露鉛致子代鼠鉛中毒的機制需進一步研究。