液相色譜結合多元統計分析多酚與煙葉香型的關系

陳森林 黃曼艷 林云 陶紅 胡玉玲 葉為民 李攻科

摘?要?采用超聲輔助萃取-液相色譜法快速測定煙葉中8種多酚類致香前體物質，通過測定51份煙葉樣品中多酚類含量差異，結合主成分分析、聚類分析和判別分析等多元統計方法，對煙葉香型進行區分和判定。結果表明，前兩個主成分累計貢獻率為67.9%，從主成分得分圖中可直觀顯示清香型、中間香型和濃香型的分類趨勢，采用層次聚類分析可將51份煙葉樣品分為3種香型，與交互驗證率為90.2%的Fisher's判別分析的結果相一致。此外，研究了多酚類物質與產地的關系，主成分得分圖中初步顯示了不同產地煙葉的分類趨勢。本研究結果表明，多酚類物質結合多元統計方法可應用于煙葉香型、產地分類的分析。

關鍵詞?液相色譜; 多元統計; 多酚; 煙葉; 香型; 產地

1?引 言

煙葉香型是影響煙葉品質的重要因素，研究不同煙葉的香型，可為煙葉的品質提供保障。煙葉香型主要分為清香型、濃香型、中間香型和過渡香型。小分子的致香成分（如糠醛、苯乙醇、大馬酮、2-乙?；量┑萚1]）是影響煙葉香型的直接因素，通過研究致香成分含量和組分變化，可以對煙葉香型[2]、產地[3]等進行分類。多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣前體物質，包括單寧類、香豆素類、黃酮類、花色素類等，在陳化的過程中降解生成小分子致香成分（如苯甲酸、糠醛、5-甲基糠醛、4-甲基兒茶酚等[4]），從而影響煙葉的香型和品質。

多酚類物質測定方法主要有近紅外光譜法[5]、分光光度法[6]和色譜法[7]等。近紅外光譜法只能單一測定某種物質，抗干擾能力弱， 且對痕量組分的定量分析不準確; 分光光度法根據吸光度的大小對多酚進行定量分析，對反應要求高，穩定性較差，更適合煙葉多酚總含量的測定; 高效液相色譜法具有穩定性高，多組分同時檢測的優勢，是煙葉中多酚類物質測定的常用方法[8，9]。在煙葉多酚測定的行業標準方法中[10]，僅測定了綠原酸、莨菪亭和蕓香苷3種多酚。為了全面研究煙葉多酚類物質的組成，可以增加多酚類化合物的測定種類， 優化前處理過程[11]和分析方法[12]。目前，采用儀器分析方法結合多元統計方法對煙葉香型、產地等信息分類和判定，是煙草行業重要的研究手段[13，14]。通過主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚類分析（Cluster analysis，CA）無監督模式的識別方法，可以從主成分得分圖和聚類樹中直觀得出未知煙葉樣品的歸類情況[15，16]，但無法直接對未知樣品進行預測和判定。因此，需要在大量已知樣品分類的基礎上建立判別模型，從而預測未知的煙葉樣品，如采用煙葉化學成分的特征光譜數據結合判別分析（Discriminate Analysis，DA）和偏最小二乘法（Partial Least squares method，PLS）對煙葉香型進行區分[17]，或測定煙葉樣品致香成分含量的差異結合神經網絡模型對庫存煙葉香型進行預測等[18]，均具有良好的識別效果。小分子致香成分是影響煙葉香型的直接因素，但煙葉致香前體物質也是影響煙葉品質的重要因素，Zhang等[19]研究了氨基酸、糖苷類成分含量差異， 采用層次聚類分析和偏最小二乘法分析不同生產時期和部位的煙葉樣品，從而為煙葉代謝過程分析提供依據。Xiang等[20]研究了煙葉中多酚和有機酸含量差異，結合多元統計分析，可對煙葉的產地、等級進行分類。宗浩等[21]證明了煙葉多酚不僅與煙葉的部位有關，不同香型的多酚類物質含量也有差異; 向剛等[22]建立了不同煙葉多酚類的指紋圖譜，為煙葉品質的研究提供了依據; 常愛霞等[23]研究了多酚類物質與香型的相關性，結合聚類分析成功地對煙葉產地進行了區分。

本研究建立了超聲輔助液液萃取-高效液相色譜快速測定煙葉中8種多酚類物質的方法，采用主成分分析、聚類分析和判別分析法研究了以煙葉多酚類物質含量差異對3種不同香型煙葉分類和判別的可行性，探究了煙葉多酚類物質與產地的關系。研究結果表明，本方法具有良好的分類效果。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

LC-2010C高效液相色譜儀（日本島津公司），配紫外檢測器; H1850高速離心機（湖南湘儀離心機有限責任公司）; AB204-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）; KQ5200數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯過濾器（上海安譜科學儀器有限公司）。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、蕓香苷、莰菲醇-3-O-蕓香糖苷標準品（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 甲醇（色譜純，DIMA公司）; 乙酸（色譜純，Sigma公司）; 煙葉樣品由廣東中煙公司提供。

2.2?色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）; 流動相A為0.5%乙酸溶液，流動相B為0.5%乙酸-甲醇溶液，梯度洗脫程序： 0～5 min， 80% B，5～35 min，80%～25% B; 柱溫： 30℃; 檢測波長328 nm; 進樣量20 μL; 流速1 mL/min。

2.3?標準溶液和樣品溶液制備

準確稱取新綠原酸（8.8 mg）、綠原酸（23.5 mg）、隱綠原酸（10.2 mg）、咖啡酸（28.1 mg）、良菪亭（26.3 mg）、香豆素（33.7 mg）、蕓香苷（25.6 mg）、莰菲醇-3-O-蕓香糖苷（5.2 mg），用甲醇溶解并定容至25 mL，于4℃避光保存。配制標準溶液時，采用逐級稀釋法配成一系列濃度的混合標準溶液。

將烘干的煙葉樣品磨成粉末，過40目篩使用。稱取50 mg干燥后煙末樣品，加入10 mL甲醇-水（2∶3，V/V）搖勻，超聲提取20 min，以8000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后，進樣分析。

2.4?數據處理

應用SPSS-24軟件進行主成分分析、層次聚類分析和判別分析。取51份不同香型煙葉樣品（具體信息見電子版文后支持信息表S1），其中，1～18號為清香型、19～35號為中間香型，36～51號為濃香型，各樣品的多酚類物質平均含量請見電子版文后支持信息表S2; 另外，取53份不同產地（湖南、云南、貴州）的煙葉樣品，采用相同的方法對煙葉的產地進行初步區分，其中1～22號產自湖南，23～42號產自云南， 43～53號產自貴州，各樣品的多酚類物質平均含量請見電子版文后支持信息表S3。

3?結果與討論

3.1?色譜條件和前處理條件優化

優化了色譜流動相，流動相A和B分別采用0.5%乙酸溶液和0.5%乙酸-甲醇溶液時，方法具有良好的穩定性和分離效果。對萃取溶劑比、超聲時間等前處理條件優化，最終確定萃取溶劑為甲醇-水（2∶3， V/V），超聲時間為20 min，可簡單快速提取煙葉中的多酚類化合物。在最佳條件下的煙葉樣品色譜圖如圖1a，多酚類標準溶液色譜圖如圖1b。

3.2?方法評價

分別配制8種多酚類物質的系列標準濃度，采用外標法進行定量分析， 結果見表1。 8種多酚類物質具有較寬的線性范圍，線性相關系數R2為0.9990～0.9998，檢出限為0.0022～0.0044 mg/g，方法回收率為80.1%～104.1%，相對標準偏差為2.2%～6.6%，滿足前處理和分析檢測方法的要求，可用于煙葉樣品中多酚類物質的測定。

3.3?主成分分析

主成分分析（PCA） 是將多個變量通過線性變換以選出較少個數重要變量的多元統計分析方法，將原始數據降維后得到主要的因子變量，以降低數據的復雜度[24]。將得到的多酚類數據進行歸一化處理后進行主成分分析，從因子載荷圖（圖2B）可見，8種多酚類物質對煙葉香型的分類均具有重要作用，得到的主成分F1和F2是原8種多酚類物質的線性組合。主成分得分圖（圖2A）中前2個主成分F1和F2累計貢獻率為67.2%，可將煙葉樣品分為3種不同的香型，且中間香型介于清香型和濃香型之間，存在一定的交叉結果，證明了根據多酚類物質判別煙葉香型分類的可行性。從因子載荷圖（圖2B）可見，綠原酸及同分異構體和蕓香苷含量是影響主成分F1的主要因素，且僅莨菪亭含量與F1呈負相關;咖啡酸、莨菪亭和莰菲醇-3-O-蕓香糖苷含量是影響主成分F2的主要因素，且綠原酸和莰菲醇3-O-蕓香糖苷含量與F2呈負相關。主成分分析是一種無監督的模式識別方法，忽略變量之間的相關性，通?？膳c聚類分析、判別分析聯用，增加結果的準確性[25，26]。

3.4?聚類分析

聚類分析作為一種無監督模式的分類方法，根據樣品含量的差異進行歸類，將具有相似性質的樣品歸為一類，從而在聚類樹圖中直觀看出每個樣品的分類信息，廣泛用于茶葉和煙葉品種和地域分類[27，28]。本研究采用The Ward系統聚類法，聚類距離采用歐氏距離，以51種煙葉樣品的酚類含量數據為變量，對3種不同香型的煙葉樣品進行聚類分析，結果如圖3所示，在T=9時，煙葉香型被分為三大類，其中一類是1～18號（除3、11號）煙葉樣品，另一類是19～35號（除25、29號）和43號樣品，其余的歸為第三類。與已知煙葉樣品的香型進行對比，其分類的準確率達到了90.8%，進一步直觀地說明了根據煙葉多酚類含量的差異結合聚類分析可以對煙葉香型進行分類，分類效果良好。

3.5?判別分析

判別分析作為一種監督模式的識別方法，通過已知樣品的分類信息建立判別模型， 可以對未知樣品進行預測和判定。以測得的多酚類物質含量建立Fisher's判別模型， 對3種不同香型的煙葉進行分類。從圖4判別分析得分投影圖中可以直觀看出組內聚類情況和組間距離大小，3種香型的種群相對集中，基本上實現分離。分別運用自身驗證法和交互驗證法對原樣品進行回判，由于交互驗證法采用刀切法進行回代判別，有利于降低用全部數據建立判別函數后再對全部樣品進行回代判別（即自身驗證法）產生的偏差，運用交互驗證法常能得出較自身驗證法更高的準確率，增加可信度。煙葉樣品回代判別的結果見表2。在自身驗證中，第1組清香型煙葉回代判別準確率為94.4%，其中1份樣品誤判為第2組; 第2組中間香型回代判別準確率為941%，其中1份樣品誤判為第3組; 第3組濃香型回代判別準確率為100%，最終得出3組香型的平均準確率為96.1%。同理計算出交互驗證法的平均回代判別準確率為90.2%。兩種驗證方法證實了利用煙葉多酚類物質含量的差異可對不同香型的煙葉樣品進行判定，從而實現對某一未知香型的煙葉樣品的預測。

3.6?煙葉多酚類與產地關系的初步探究

測定了53份不同產地煙葉樣品多酚類物質的含量，其數據進行歸一化處理后，采用主成分分析法對煙葉產地進行初步探究。 從圖5可見，提取的3個主成分的累計貢獻率為78.4%，3種地域有分類的趨勢，但是湖南煙葉主成分得分較分散，可能是因為湖南地區的煙葉種植地區較分散，導致酚類含量的差異較大;其次， 還可以控制煙葉測定的部位，使測定的結果有更好的分類效果。圖5的結果初步表明，多酚類致香前體物質與煙葉產地具有相關性。

4?結 論

采用超聲萃取-液相色譜法測定了煙葉中8種多酚類致香前體物質，方法簡單快速，具有良好的穩定性和精密度，可用于多酚類物質測定。利用主成分分析、聚類和判別分析方法對多酚類物質含量的差異進行分析， 實現對煙葉的香型和地域的分類和判定，推測多酚類物質與煙葉香型、產地的相關性，為煙葉香型和產地的研究提供了新的研究思路，從而為煙葉品質研究提供更多的依據。

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