自然發酵酸漿中一株高產酸菌的分離與鑒定

佟梓沂,孫秀宇,王 冰,楊 楊,石彥國,王世杰,朱 宏,張 娜,*

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050000; 3.石家莊君樂寶乳業有限公司,河北石家莊 050221)

本研究采用平板涂布法[7]并以各分離菌株在黃漿水中的代謝能力作為評價指標,從云南宣威特色黃豆腐制作所用自然發酵酸漿中分離篩選出優勢產酸菌種,并將其進行細胞形態學、生理生化學及分子生物學鑒定,以期實現酸漿豆腐的工業化、標準化、穩定化、安全化生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發酵酸漿樣品 取樣自云南宣威市倘塘鎮黃豆腐加工作坊;黃漿水 實驗室自制;鹵片 天津市鑫達宇化工有限公司;MRS肉湯培養基、MRS固體培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;鹽酸、碳酸鈣 均為分析純,天津市天力化學試劑有限公司;草酸銨結晶紫染色液 北京索萊寶科技有限公司;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒、DNA Ladder Mix maker 上海生物工程有限公司。

VD-650超凈工作臺 濟南創日新儀器設備有限公司;AR224CN型電子分析天平 上海天平儀器有限公司;DHP電熱恒溫培養箱 常州菲普實驗儀器廠;MLS-3781-PC型立式壓力蒸汽滅菌器 廈門理化儀器有限公司;PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠;TG16-W高速離心機 江蘇捷達離心機制造有限公司;SP-BM-30光學顯微鏡、SU1510掃描電子顯微鏡 上海BM光學儀器制造有限公司;ABI3730-XL測序儀 天津基景公司;FR980凝膠成像儀 上海復日科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃漿水的制備 實驗室以鹵水為凝固劑點制豆腐[8],取豆腐壓制過程中產出的黃漿水1000 mL,115 ℃滅菌15 min加入10%取自云南的酸漿樣品使其發酵產酸,待黃漿水pH下降至4.0以下即為一代酸漿。以一代酸漿為豆腐凝固劑點制豆腐[9],取壓制后剩余的黃漿水同樣滅菌處理后接入10%一代酸漿進行自然發酵,待pH降至4.0以下即可作為二代酸漿進行點制豆腐。如此循環三代后可消除鹵水中離子對實驗的影響。本實驗自制黃漿水為三代后酸漿點制豆腐過程中所產生的,自制黃漿水pH在5.5～5.8之間,直接作為培養基用于分離菌的培養。

1.2.2 高產酸菌的分離、純化 采用平板涂布法,將用無菌生理鹽水稀釋107倍后的酸漿樣品涂布于MRS分離培養基平板上,37 ℃恒溫靜置培養18～24 h,挑取有明顯溶鈣圈的單菌落進行反復分離劃線,結合表觀判斷與鏡檢，純化3～4代并進行4 ℃菌種斜面保存以及-20 ℃甘油管凍存。

鏡檢:取單菌落在無菌環境下于載玻片上涂成菌膜,經干燥、固定后用草酸銨結晶紫進行染色,30 s后用水沖洗并用吸水紙吸取多余的水。制好的片用顯微鏡在100倍油鏡下觀察,觀察并記錄菌體形態以判斷菌落中是否有雜菌存在。

1.2.3 高產酸菌的篩選 將分離純化得到的四株產酸菌接入MRS肉湯培養基，于37 ℃恒溫培養24 h進行擴大培養后，按5%的接種量接種于黃漿水培養基中，37 ℃恒溫培養48 h,每6 h測定不同菌種發酵液的pH與總產酸量,對分離菌種的產酸量和pH下降速率進行比較、篩選,對篩選獲得的菌株進行鑒定。

1.2.4 產酸量的測定 取5.00 mL發酵液放入250 mL的錐形瓶中，用去CO2水適當稀釋,加入5滴0.1%酚酞指示液,搖勻,用鄰苯二甲酸氫鉀標定的0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色,30 s內不褪色,記錄氫氧化鈉標準溶液消耗量,按如下公式計算產總酸量[10]。

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式中:C2-產酸量,g/L;C1-NaOH溶液濃度,mol/L;K-酸換算系數,用乳酸表示,K=0.090;F-試液稀釋倍數;V1-NaOH滴定發酵液消耗的體積,mL;V2-NaOH滴定空白對照消耗的體積,mL;V3-待測發酵液體積,mL。

1.2.5 高產酸菌的形態特征觀察及生理生化特性 對篩選獲得的高產酸菌株進行菌落形態觀察,拍照。將菌種培養液以5000 r/min的速度離心5 min,取菌體加入2.5% pH6.8的戊二醛置于4 ℃冰箱固定1.5 h以上,取出后用0.1 mol/L的酸性磷酸緩沖液沖洗2～3次,每次10 min。然后對菌體依次用濃度為50%、70%、90%的乙醇進行脫水,每次10～15 min。脫水后的菌體樣品用無水乙醇與純叔丁醇1∶1的混合液置換后于-45 ℃進行冷凍干燥4 h,干燥后的樣品鍍金,利用電子掃描顯微鏡觀察菌體細胞形態特征[11]。

對篩選出的高產酸菌株進行常規生理生化鑒定,試驗包括革蘭氏染色實驗、過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、硫化氫實驗、明膠液化、吲哚試驗實驗以及對乳糖、木糖、蔗糖、果糖、棉子糖、麥芽糖、甘露醇、麥芽糖、鼠李糖、核糖、纖維二糖的發酵試驗[12]。

1.2.6 乳酸菌序列測定與系統發育分析

1.2.6.1 細菌基因組DNA的提取 利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。

1.2.6.2 細菌基因組PCR 擴增 上游引物為5′-CAGAGTTTGACCTTGG-3′(7F);下游引物為:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(1540R)。PCR 擴增反應體系擴增體系:成分Template(基因組DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL,F(10 μmol/L)0.5 μL,R(10 μmol/L)0.5 μL,加ddH2O至25 μL。PCR擴增反應程序:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性45 s 30 cycles,55 ℃退火45 s 30 cycles,72 ℃ 1 min 30 cycles,72 ℃修復延伸10 min,4 ℃儲藏,終止反應。反應完成后,取3 μL PCR產物進行1%瓊脂凝膠電泳檢測,確認PCR擴增片段。PCR產物的回收:PCR產物用SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒回收,具體操作按試劑盒說明書進行。序列測定:取各個菌種純化后的PCR產物,使用測序儀進行DNA 測序。將擴增好的DNA進行鑒定。

1.2.6.3 系統發育樹的建立 將鑒定出的基因序列在NCBI通過BLAST進行比較,確定種屬及親緣關系,即為16S rDNA的鑒定結果[13]。對基因序列進行ITS同源性分析并建立系統發育樹。

1.3 數據處理

實驗數據利用Excel軟件和SPSS 19.0軟件進行分析處理,用MEGA 5.0軟件對菌株的基因序列進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 高產酸菌的分離篩選

從云南宣威自然發酵酸漿中分離出4 株產酸菌分別編號為T-01、T-02、T-03、T-04,以總產酸量與體系pH下降速率為考察指標,測定四株菌在黃漿水中的代謝能力。結果如圖1、圖2所示,菌株T-02在黃漿水中發酵48 h后pH下降至3.6以下,總產酸量可達40.8 g/L,均高于其它菌株,且培養24 h后pH便下降至3.6,總產酸量達35.3 g/L。利用菌株T-02發酵時,黃漿水pH下降最快,產酸速率最高,產酸總量最大。

圖1 發酵液產酸量變化曲線Fig.1 Change in acid yield of fermentation broth

圖2 發酵液pH變化曲線Fig.2 Change in pH value of fermentation broth

其他學者也曾對自然發酵酸漿中的高產酸菌進行分離鑒定,葉青等[14]曾在豆腐酸漿中分離出一株產酸乳酸菌,在黃漿水中發酵24 h后產酸量達27 g/L,經鑒定為干酪乳桿菌;喬支紅等[15]在豆腐酸漿老湯中分離出一株高產乳酸菌,發酵24 h后產酸量達43 g/L,經鑒定為屎腸球菌。王國良在豆腐酸漿中分離到一株嗜酸乳桿菌,黃漿水中發酵24 h酸度達到24.9 g/L[16]。劉倩等[17]在傳統發酵酸漿中分離出一株解淀粉乳桿菌,在黃漿水中發酵24 h,產酸量為30 g/L。本研究從云南宣威自然發酵酸漿中分離篩選出一株高產酸乳酸菌T-02,該菌株在黃漿水中經24 h發酵產酸量高達35.3 g/L,pH下降至3.6,發酵48 h最高產酸量達到40.8 g/L,其產酸能力優于其他研究人員分離得到的產酸微生物,因此將本實驗分離菌株應用到酸漿發酵和酸漿豆腐制作中有助于縮短發酵時間,提高生產效率。

2.2 分離高產酸菌體形態觀察及生理生化實驗

圖3、圖4分別為分離得到的高產酸菌株的菌落形態特征圖和菌體掃描電鏡圖。據菌落及菌體掃描電鏡圖可以看出,菌株T-02 在MRS固體培養基上生長良好,菌落直徑在1～3 mm之間,為不透明乳白色的正圓形,頂部微凸起,邊緣整齊,菌落表面濕潤有光澤,易挑起。通過電子掃描電鏡觀察可知該菌株細胞形態為兩端圓的短桿狀,不運動,無芽孢,無鞭毛,符合典型乳酸菌的形態學特征[18]。

圖3 菌株 T-02菌落形態(10×)Fig.3 The colony morphology of strain T-02(10×)

圖4 菌株T-02掃描電鏡圖(5000×)Fig.4 Scanning electron micrograph of strain T-02(5000×)

參照伯杰氏《常見細菌系統分類學手冊》[19],對菌株T-02進行的生理生化實驗結果見表1。

由表1可以看出菌株T-02是革蘭氏陽性菌,過氧化氫酶試驗、淀粉水解試驗、H2S試驗、明膠液化、硝酸鹽還原、吲哚試驗、V. P試驗均呈陰性,葡萄糖酸鹽試驗為陽性,可利用木糖、蔗糖、果糖等大多數糖進行發酵,但不能利用鼠李糖。對照伯杰氏《 常見細菌系統分類學手冊》可知,該菌株部分生理生化特性與糖發酵試驗結果,初步判斷該菌株為厚壁菌門,乳桿菌科,乳桿菌屬。

表1 菌株生理生化特性Table 1 Strain physiological and biochemical characteristics

2.3 分子生物學鑒定

將提取到的菌株T-02的部分DNA基因序列(基因序列長度為1517 bp)在NCBI上進行BLAST比對發現T-02號菌株的基因序列與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)基因序列相似性均高達99%。對菌株的基因序列進行系統發育分析[20],得到系統進化樹如圖5所示。

圖5 菌株T-02系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain T-02

由系統發育樹可知,該分離菌株T-02與菌株LactobacillusplantarumKP144184.2(植物乳桿菌)、菌株LactobacilluspentosusFJ542297.1(戊糖乳桿菌)具有最高的基因序列相似度。根據細胞形態學特征,該分離菌株與其他自然發酵食品中分離出來的植物乳桿菌菌落及細胞形態及其相似[20-23]。在生理生化特征方面,該分離菌株T-02除不能利用鼠李糖作為第一碳源外可利用乳糖、果糖等其他糖作為第一碳源,這些與植物乳桿菌的特征最為接近,因此可結合細胞形態學,生理生化及分子生物學鑒定,將該分離菌株T-02確定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

3 結論

從云南宣威自然發酵酸漿中分離出四株產酸菌,對四株產酸菌進行復篩,篩選出一株高產酸菌T-02。該菌株在黃漿水中發酵24 h后pH下降至3.6,產酸量為35.3 g/L,發酵48 h達到最高產酸量為40.8 g/L,pH下降至3.6以下。該菌株在所有分離產酸菌中pH下降速率最快,產酸量最高,具有較好的產酸能力,可以作為酸漿豆腐的酸漿純菌種發酵菌株。通過菌落形態和菌體細胞形態觀察,結合生理生化試驗、16s RNA鑒定及基因序列的比對,可確定該分離高產酸菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。