黃豆幼苗生長過程中第一真葉與第二真葉生理指標的比較

張文韜 章有知

摘要：以黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗的第一真葉和第二真葉為研究對象，測定了第一真葉和第二真葉的可溶性蛋白質、光合色素、丙二醛和抗壞血酸含量以及過氧化氫酶和過氧化物酶活性。結果表明，第一真葉與第二真葉中的可溶性蛋白質含量沒有顯著性差異;第二真葉中的葉綠素a和類胡蘿卜素含量高于第一真葉，分別高23.4%和89.9%，第一真葉中的葉綠素b含量高于第二真葉，高76.9%，總光合色素含量在第一真葉與第二真葉中較為接近，第二真葉中葉綠素a/b的值是第一真葉中的2.18倍;第一真葉的丙二醛含量高于第二真葉，前者是后者的3.04倍;第二真葉的抗壞血酸含量高于第一真葉，是后者的1.52倍;兩真葉中未測到過氧化物酶和過氧化氫酶活性?？箟难岷颗c可溶性蛋白質含量、丙二醛含量和葉綠素b含量為負相關，與葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量為正相關。

關鍵詞：黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill];幼苗;第一真葉;第二真葉;生理指標

中圖分類號：S529? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）05-0021-04

Abstract： Soluble protein content， photosynthetic pigment content， MDA content， ascorbic acid content， enzyme activity and peroxidase activity of hydrogen peroxide in the first leaf and the second leaf of soybean [Giycine max （Linn.） Merrill] seedlings were determined. The results showed that there was no significant difference in soluble protein content between the first and second true leaf. The content of chlorophyll a and carotenoid in the second leaf was 23.4% and 89.9% higher than those in the first leaf， respectively. The content of chlorophyll b in the first leaf was 76.9% higher than that in the second leaf. The total photosynthetic pigment content in first leaf and second leaf were close to each other. The value of chlorophyll a/b in the second leaf was about 2.18 times higher than that in the first true leaf. The MDA content in the first true leaf was 3.04 times higher than that in the second true leaf. The content of ascorbic acid in the second leaf was 1.52 times higher than that in the first true leaf. The peroxidase activity and catalase activity could not been determined in these two leaves. Besides that， ascorbic acid content was negatively correlated with the content soluble protein， MDA and chlorophyll b， and was positively correlated with the content of chlorophyll a and carotenoid.

Key words： soybean[Giycine max （Linn.） Merrill]; seedling; the first leaf; the second leaf; physiological index

真葉是維管植物最為重要的器官之一。真葉葉片作為植物主要的光合器官，是植物生長過程中能量和物質的最主要來源，其生理狀態和形態對植物的光合作用、蒸騰作用與抗逆性等生理功能以及植物的生長發育都有很大的影響。如小麥的旗葉和水稻的劍葉都對其本身的產量有較大影響。因此研究黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗真葉葉片的指標，判斷其生理學功能和生理狀態對黃豆也具有重要的生產和實踐意義。本試驗選擇黃豆幼苗生長過程中的第一真葉和第二真葉為研究對象，測定了第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）、可溶性蛋白質、光合色素、丙二醛含量以及過氧化物酶和過氧化氫酶活性等生理指標。

擬南芥AsA突變體植株中，AsA含量的降低導致擬南芥細胞的分裂和生長受到了抑制，從而使得擬南芥嫩枝生長速率降低[1]。還有研究發現，紫黃質脫環氧酶和一些次生代謝物所需的代謝酶類都需要AsA作為輔因子[2]，參與細胞內的生物化學反應，調節細胞的生長狀態。此外，AsA在植物中具有清除自由基和抗氧化的生理功能，在植物的光保護和光合作用、細胞生長和分裂等諸多生理過程中也有著非常重要的生理調節功能[3-5]。此外，在清除植物體內因環境脅迫、光合作用和氧代謝等產生的活性氧的過程中，AsA可以起到直接的降低作用[6]。植物PS Ⅰ中氧的光還原過程會產生H2O2，其必須通過AsA過氧化酶清除。AsA同樣也是PS Ⅱ的電子供體[6，7]。因此，植物細胞內AsA含量的增加往往能增強植物抵抗逆境的能力而延緩衰老。鑒于以上原因，在測定抗壞血酸、可溶性蛋白質、光合色素、丙二醛及過氧化物酶和過氧化氫酶活性后，對抗壞血酸含量與其他生理指標的相關性也初步進行了分析。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗材料? 選擇大小均一的黃豆種子在裝有河沙的種植盆（長30 cm，寬30 cm，深10 cm;其中河沙深度8 cm，河沙經去離子水清洗）中，6行6列（30顆/盆），塑料薄膜覆蓋，種植盆置于光照培養箱內，條件為白天28 ℃/12 h，夜間20 ℃/12 h，光照度為800 μmol/（m2·s），相對濕度75%，出苗后開始每隔1 d向種植盆內均勻噴灑Hoagland營養液200 mL。待幼苗長至第三真葉時，選擇長勢整齊植株的第一真葉和第二真葉進行測定。第一真葉和第二真葉樣本數不少于30。

1.1.2? 試驗試劑? 牛血清標準蛋白、考馬斯亮藍G250、85%偏磷酸、濃鹽酸、2，6-二氯酚靛酚、抗壞血酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氫氧化鈉、石英砂、碳酸鈣、愈創木酚、Na2HPO4、KH2PO4、H2O2、96%乙醇，均為分析純，試驗用水為去離子水。

1.1.3? 試驗儀器? T6新悅分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;HZT-B3000電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;臺式高速離心機（Sigma）;pH試紙;UVmini1240紫外分光光度計（島津）;水浴鍋;電爐（天津泰斯特儀器有限公司）;藥品低溫冰箱（海爾）等。

1.2? 方法

1.2.1? 黃豆葉片的預處理? 選取黃豆幼苗第一真葉和第二真葉，用去離子水清洗新鮮葉片表面后，用吸水紙吸干表面水分，在電子天平上進行稱量，并記錄質量。

1.2.2? 生理指標含量的測定? 葉片中可溶性蛋白質含量、光合色素含量、丙二醛含量和過氧化氫酶活性的測定和計算參考文獻[8]進行;過氧化物酶活性的測定和計算參考文獻[9]進行;抗壞血酸含量的測定和計算參考文獻[10]。

1.2.3? 數據分析? 數據分析采用SPSS 13.0軟件進行，顯著性檢驗采用配對t檢驗，相關分析采用兩因素相關分析中的Spearman相關。

2? 結果與分析

2.1? 各生理生化指標表現

2.1.1? 光合色素含量? 將試驗中測定的665、649、470 nm處的吸光度按公式進行計算，得出第一真葉和第二真葉中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，并計算總光合色素含量和葉綠素a/b，結果見圖1。由圖1可知，第二真葉中的葉綠素a和類胡蘿卜素含量高于第一真葉，分別高23.4%和89.9%;第一真葉中的葉綠素b含量高于第二真葉，高76.9%;總光合色素含量在第一真葉和第二真葉中較為接近。第二真葉中葉綠素a/b是第一真葉中的2.18倍。

對第一真葉和第二真葉中的光合色素含量值進行獨立樣本t檢驗，葉綠素a的雙尾顯著性檢驗P為0.002，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉和第二真葉中葉綠素a含量有極顯著性差異;葉綠素b和類胡蘿卜素的雙尾顯著性檢驗P均為0.000，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉和第二真葉中葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量均有極顯著性差異;對葉綠素a/b進行獨立樣本t檢驗，雙尾顯著性檢驗P均為0.000，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，葉綠素a/b有極顯著性差異。

2.1.2? 可溶性蛋白質含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉的可溶性蛋白質含量略高于第二真葉。對第一真葉和第二真葉中的可溶性蛋白質含量值進行獨立樣本t檢驗，雙尾顯著性檢驗P為0.478，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉和第二真葉中可溶性蛋白質含量沒有顯著性差異。

2.1.3? 丙二醛含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉的丙二醛含量高于第二真葉，前者是后者的3.04倍。對第一真葉和第二真葉中的丙二醛含量進行獨立樣本t檢驗，雙尾顯著性檢驗P為0.000，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉和第二真葉中丙二醛含量有極顯著性差異。

2.1.4? 抗壞血酸含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長發育過程中，第二真葉的抗壞血酸含量高于第一真葉，是后者的1.52倍。對第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量進行獨立樣本t檢驗，雙尾顯著性檢驗P為0.002，說明在黃豆幼苗生長發育過程中，第一真葉與第二真葉中抗壞血酸含量有極顯著性差異。

2.1.5? 過氧化物酶和過氧化氫酶活性? 利用分光光度法分別測定了第一真葉和第二真葉的過氧化物酶和過氧化氫酶活性，但測定結果顯示，過氧化物酶和過氧化氫酶基本無活性。

2.2? 抗壞血酸含量與其他各指標間的相關性分析

2.2.1? 抗壞血酸含量與可溶性蛋白質含量的相關關系? 對測定的第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量與可溶性蛋白質含量進行Spearman相關分析，相關系數為-0.177，表明抗壞血酸含量與可溶性蛋白質含量為負相關;P為0.738，相關不顯著（表2）。

2.2.2? 抗壞血酸含量與光合色素含量的相關關系? 由表2可知，在黃豆幼苗生長過程的第一真葉期和第二真葉期中，抗壞血酸含量與葉綠素a、類胡蘿卜素含量為正相關，與葉綠素b含量為負相關，所有相關檢驗的P均未達到顯著性水平。

2.2.3? 抗壞血酸含量與丙二醛含量的相關關系? 對測定的第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量與丙二醛含量進行Spearman相關分析，相關系數為-0.618，抗壞血酸含量與丙二醛含量為負相關;P為0.191，相關不顯著（表2）。

3? 小結與討論

3.1? 討論

植物體內的可溶性蛋白質是植物組織的保護物質，可降低組織或者細胞的冰點，使細胞的水合度增大，保水能力增強，避免原生質在低溫下受到傷害[11]?？扇苄缘鞍踪|也是植物的滲透調節劑之一，蛋白質含量增加，降低細胞的滲透勢[12，13]。作為一種在植物體內具有調節和保護功能的物質，目前可溶性蛋白質的研究更多地是集中于植物在寒冷、鹽脅迫等逆境中其含量的變化上[11-16]，較少關注植物生長發育過程中不同階段的含量變化。黃豆幼苗生長發育過程中，對可溶性蛋白質的試驗測定結果表明，第一真葉與第二真葉中的可溶性蛋白質含量接近，說明在黃豆幼苗生長發育的早期，不同生長時間的真葉葉片中可溶性蛋白質含量變化不大。

植物光合作用的基礎是光合色素，各種光合色素含量的不同會影響植物的光合作用速率[17]。本試驗結果表明，在黃豆幼苗的功能葉片中，第二真葉的葉綠素a含量高于第一真葉，該結果與花生幼苗生長發育過程中功能葉片的結果是一致的[18]。陽生植物中，葉綠素a與葉綠素b的比值大于陰生植物，該比值可以反映植物對光能的利用程度[19]。本試驗結果顯示，第二真葉中的葉綠素a/b大于第一真葉，說明第二真葉對光能的利用率要高于第一真葉。

作為膜脂過氧化的產物，丙二醛含量的高低可以反映細胞質膜過氧化的程度[20]。植物在生長過程中，生成的丙二醛含量可以使葉綠素和蛋白質降解，進而使植物的葉片凋亡和脫落[21，22]。第二真葉中的丙二醛含量遠低于第一真葉，說明第二真葉的膜脂過氧化程度遠低于第一真葉。結合葉片中可溶性蛋白質和葉綠素含量的結果，丙二醛對可溶性蛋白的降解影響更小，而對光合色素的作用可能會更大。具體而言，丙二醛可能對葉綠素a的降解作用更為顯著。

另外，抗壞血酸在清除自身的活性氧和抗氧化方面具有重要的生理功能，類胡蘿卜素也是植物體內重要的抗氧化劑[20]。第二真葉中較高的抗壞血酸和類胡蘿卜素含量可能在植物生長的早期維持了植物體內較低的過氧化物水平，作為植物體內的第一道防線在賦予植物的抗氧化能力上具有重要作用。其內在關系可能是，高抗壞血酸和高類胡蘿卜素含量降低了植物體內的O2-·，進而降低了植物膜脂的過氧化水平，降低了丙二醛含量。當此作用可以維持植物體內較低的丙二醛含量水平時，植物可以避免合成相關的過氧化物酶類，從而維持植物體內物質和能量流動的最佳方向。這也可能是本試驗中沒有測定出過氧化物酶活性的內在原因。

3.2? 小結

通過對黃豆幼苗生長發育早期中第一真葉和第二真葉的部分生理數據進行比較可知，第一真葉中較高的丙二醛含量與較低的葉綠素a含量和較高的葉綠素b含量對應，第二真葉中較低的丙二醛含量與較高的葉綠素a含量和較低的葉綠素b含量對應，判斷丙二醛對葉綠素a具有較大的破壞作用，對葉綠素b則不具有破壞性，說明MDA對光合色素的破壞具有選擇性;抗壞血酸含量與可溶性蛋白質、葉綠素b和丙二醛含量呈負相關，與葉綠素a和類胡蘿卜素含量呈正相關，但相關均不顯著。

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