二甲雙胍對慢性應激大鼠抑郁行為的影響*

李改芬， 趙 名， 趙 彤， 成 祥， 范 明△， 朱玲玲△

(1. 首都醫科大學腦重大疾病研究中心， 北京腦重大疾病研究院， 北京 100069； 2. 軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所， 北京 100850)

抑郁癥是一種比較常見的情感障礙性疾病，近年來其發病率越來越高，嚴重影響患者的身心健康，觀察發現導致抑郁癥患者發病的原因大多是由于各種各樣的壓力刺激所致，包括外在環境壓力和內在精神壓力[1]。雖然在當前抑郁癥的確切發病機制還未查明，但經前期大量研究發現，抑郁癥被認為是一種神經系統疾病，抑郁癥的發生發展與海馬的病理變化呈正相關[2]。眾所周知，糖尿病是一種常見的慢性疾病，在疾病的長期折磨下，糖尿病患者并發抑郁癥的人數明顯高于正常人[3]。臨床調研發現，糖尿病合并抑郁癥的患者經過抗糖尿病治療后，不僅血糖得到有效控制，抑郁癥狀也有所減輕[4]。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病的臨床一線藥物，其藥理作用不僅包括降低血糖，還有抗衰老和神經保護的作用[5]；并且二甲雙胍聯合抗壞血酸能夠減輕糖尿病和抑郁癥共患病患者的抑郁癥狀[6]，因此，本研究在慢性不可預測性溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS) 大鼠抑郁模型上探討二甲雙胍的抗抑郁作用及其初步的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

SPF級的SD大鼠40只，8周齡，體重(280～300)g，雄性，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006，質量合格證號：11400700259457。 實驗前適應性飼養3 d，室溫(23±2)℃，濕度50%～70 %，光照與黑暗交替為12 h /12 h，可自由飲水攝食。

二甲雙胍(S1741)，由碧云天生物技術有限公司提供。二甲雙胍用生理鹽水溶解，新鮮配制，每天腹腔注射100 mg/kg，處理時間為14 d[7-9]。

1.2 CUMS抑郁模型的建立

按照文獻方法[2，10]進行抑郁大鼠模型的復制。刺激包括鼠籠傾斜45° 24 h，束縛應激2 h，潮濕墊料24 h，禁食24 h，禁水24 h，夾尾1 min，4℃冰水游泳5 min，45℃熱刺激5 min，噪音2 h，持續照明24 h，閃光燈照明24 h(光暗周期2 h / 2 h)。上述11種應激隨機安排，每天1種刺激，相鄰兩天同一刺激不可連續出現，使大鼠不能預測應激。

1.3 動物分組及給藥

將動物隨機分為4組(n=10)：對照組(CON組)、二甲雙胍組(MET組)、模型組(CUMS組)、模型+二甲雙胍組(CUMS+MET組)；兩個二甲雙胍組在模型制備完成后每天腹腔注射二甲雙胍(100 mg/kg)1 ml，對照組和模型組注射等體積的生理鹽水，連續注射14 d。所有的實驗動物管理及實驗均遵守中華人民共和國衛生部動物實驗管理條例和軍事醫學研究院實驗動物管理條例。

1.4 實驗方法

(1)體重測量：在實驗開始前，測一次大鼠體重，各組大鼠體重無差異。實驗開始后，每周測一次體重。(2)糖水偏好實驗：訓練期：每只大鼠禁水禁食23 h，然后給予一瓶1%糖水和一瓶純水，每隔5 min交換一下水瓶的位置，持續1 h。測試期：每只大鼠禁水禁食23 h后給予提前稱好的1%糖水和純水，每隔5 min交換一下水瓶位置，持續1 h，最后記錄兩個水瓶消耗量并計算糖水偏愛率，糖水偏愛率=1%糖水飲用量/(1%糖水飲用量+純水飲用量)。(3)強迫游泳實驗：將大鼠放入盛有40 cm水的水池中，確保大鼠尾尖觸碰不到水池底部，強迫大鼠游泳，水溫為室溫，每只大鼠單獨測試，每次測試5 min，觀察并記錄大鼠累計游泳不動時間。靜止不動：停止掙扎或呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面。(4)懸尾不動實驗：將大鼠尾端3 cm部位固定在水平木棍上，使大鼠呈倒懸狀態，頭部距地面5 cm左右，每只大鼠單獨測試，測試5 min，觀察每只大鼠累計不動時間并計時。(5)曠場實驗：應用ANY-maze動物行為分析系統檢測大鼠的自主活動情況，每只大鼠提前適應5 min，然后將大鼠放入九宮格中，每次放1只，由計算機自動記錄大鼠的活動情況，每次5 min。每只動物測試完畢將場地清理干凈，并用酒精噴灑祛除異味。主要觀察指標為總運行距離和在中央區域運行的距離。

1.5 實驗動物取材

所有行為學測試完畢后進行動物取材，將動物用戊巴比妥(60 mg/kg, 腹腔注射)進行麻醉，斷頭并剝離腦組織將其放入預先準備好的組織固定液(4%多聚甲醛)中固定并保存。

1.6 尼氏染色

(1)將切好的石蠟切片放入烤箱，65℃過夜；(2)第2日將切片取出放入二甲苯中脫蠟，每次10 min，共3次；(3)將切片依次放入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脫水，各2 min，然后用蒸餾水沖洗3次，每次5 min；(4)將切片放入提前備好的1%甲苯胺藍中進行染色，37℃孵育30 min，然后用蒸餾水沖洗3次，每次5 min；(5)95%乙醇分化至尼氏小體呈藍色；(6)100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 二甲雙胍對CUMS大鼠體重的影響

抑郁癥的臨床表現中包括食欲不振，因此我們每周測一次大鼠的體重，觀察各組大鼠的體重增長變化。體重測量結果如表1顯示：CON組與MET組相比，兩組大鼠體重增長無明顯變化，差異無統計學意義；CUMS組與CUMS+MET組相比，兩組大鼠體重增長無明顯變化，差異無統計學意義，提示二甲雙胍腹腔注射不會影響大鼠的體重增長。但是與CON組相比，CUMS組大鼠體重增長明顯較慢(P<0.01或P<0.05)，差異有統計學意義；經過二甲雙胍處理后， CUMS大鼠的體重增長仍然明顯較慢，再次提示二甲雙胍腹腔注射不會影響大鼠的體重增長，并且說明CUMS可以導致大鼠體重增長減慢。

Tab. 1 Effects of metformin on the rats’ body weight (g, n=10)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group

2.2 二甲雙胍對CUMS大鼠糖水偏愛的影響

糖水偏愛實驗可以檢測大鼠是否有快感缺乏，而快感缺乏是抑郁癥的癥狀之一。實驗結果如表2所示：3周CUMS應激后，CUMS組和CUMS+MET組大鼠的糖水偏愛率與CON組相比均明顯降低(P<0.01或P<0.05)，差異有統計學意義，提示CUMS抑郁模型可以建立成功；5周CUMS應激后即二甲雙胍注射2周后，與CON組相比， CUMS組大鼠的糖水偏愛率明顯降低，而CUMS+MET組大鼠的糖水偏愛率有所上升(P<0.01或P<0.05)，差異有統計學意義，提示二甲雙胍可以改善CUMS大鼠的糖水偏愛率。

GroupAfter 3 weeks of CUMSAfter 5 weeks of CUMSCON60.94±5.9463.36± 5.24MET60.68±5.0661.19± 6.22CUMS37.45±3.22**48.72±15.44*CUMS+MET37.62±3.40**59.31±17.14#

In this experiment, CUMS stress stimulation lasted for 5 weeks, metformin was injected intraperitoneally in the last 2 weeks. CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;#P<0.05vsCUMS group

2.3 二甲雙胍對CUMS大鼠的懸尾不動和強迫游泳不動的影響

懸尾不動實驗和強迫游泳不動實驗可以檢測大鼠是否具有絕望無助行為表現，絕望無助是抑郁癥的重要表型之一。實驗結果如表3所示：與CON組相比， CUMS組大鼠的懸尾不動時間和強迫游泳不動時間均明顯延長(P<0.01或P<0.05)，差異有統計學意義，提示CUMS組大鼠出現絕望無助行為。與CUMS組比較，二甲雙胍注射兩周后，CUMS+NET組大鼠的強迫游泳不動時間明顯減少(P<0.01或P<0.05)，差異有統計學意義，但是大鼠的懸尾不動時間沒有明顯減少，差異無統計學意義，提示二甲雙胍可以改善大鼠的強迫游泳不動。

GroupTSTFSTCON104.66±48.2104.50±2.953MET88.70±26.7084.80±2.043CUMS138.61±35.593*44.56±16.627**CUMS+MET104.85±37.63226.80±15.339#

TST: Tail suspension test; FST: Forced swimming test; CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.4二甲雙胍對CUMS大鼠自發活動的影響

自發活動可以說明大鼠的抑郁狀態，自發活動減少說明大鼠處于抑郁狀態中。實驗結果如圖1顯示：與CON組相比， CUMS組大鼠在曠場中總運行距離減少、在中央區域運行距離減少、穿越中央區域的次數減少(P<0.05)，差異有統計學意義，提示CUMS組大鼠處于抑郁狀態中，而經過二甲雙胍處理后的CUMS+MET組的大鼠在曠場中總運行距離增加(P<0.05)，差異有統計學意義，在中央區域運行距離沒有顯著增多、穿越中央區域次數沒有顯著增多，差異無統計學意義，但是具有增多的趨勢；綜上結果，提示二甲雙胍可以增加CUMS大鼠的自發活動,改善其抑郁狀態。

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.5 二甲雙胍對CUMS大鼠海馬形態結構的影響

既往報道提示，慢性應激會導致海馬的功能和形態發生異常改變，尤其是海馬CA1區和CA3區對慢性應激刺激比較敏感。正常情況下，大鼠海馬神經元結構完整、染色均一、細胞排列整齊。根據實驗結果(圖2)可得：CON組和MET組大鼠海馬CA1和CA3區的細胞排列較為整齊，染色均一，細胞結構完整。而CUMS組與CON組相比，其大鼠海馬CA1和CA3區細胞排列紊亂、個數減少、染色變淺、細胞之間的間隙增大；經過二甲雙胍處理后的CUMS+MET組大鼠的海馬CA1和CA3區的細胞排列紊亂、個數減少、染色較淺、細胞間隙增大的問題有所改善。上述海馬形態結構變化提示二甲雙胍可以修復CUMS導致的海馬形態結構紊亂。

3 討論

CUMS是國內外公認的動物抑郁癥模型，因其能模擬抑郁癥的環境誘因，誘導實驗動物出現抑郁核心癥狀,所有被廣泛應用于抑郁癥的發病機制和抗抑郁新藥研究[11]。大腦海馬是應激反應的作用靶區，參與情緒反應和學習記憶，其損傷與抑郁癥的發生發展密切相關[2]；而且糖尿病與抑郁癥皆可損傷海馬血腦屏障的完整性[12]。因此本實驗采用二甲雙胍對CUMS抑郁模型進行干預，觀察其療效及其可能的作用機制，并作尼氏染色觀察各組大鼠海馬形態變化。行為學結果顯示CUMS抑郁模型大鼠體重增長顯著減慢，糖水消耗量顯著降低，懸尾不動和強迫游泳不動時間顯著延長，自發活動明顯減少，表明CUMS大鼠出現快感缺乏、絕望無助癥狀，處于抑郁狀態，抑郁模型建立成功。經過二甲雙胍處理，CUMS大鼠海馬的CA1和CA3區的神經元得到明顯恢復，抑郁行為得到明顯改善；與既往報道一致，上述行為學的改變與大鼠海馬的形態變化保持一致，表明二甲雙胍發揮抗抑郁的效應可能與修復受損的海馬有關。

Fig.2Effects of metformin on hippocampal morphology in CUMS rats(Nissl staining,n=3)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and Metformin group; Hipp: Hippocampus. The districts of CA1 and CA3 are the part of the gray box shown in the top picture respectively, both of their magnification times are 40x

近年來糖尿病和抑郁癥兩病共患的發病率逐漸升高，在糖尿病并發抑郁癥的患者中發現，經過抗糖尿病藥物的治療，患者的血糖和抑郁癥狀都得到了有效的控制，因此，越來越多的抗糖尿病藥物被用于研究其是否具有抗抑郁的效應以及可能的作用機制。研究報道慢性應激刺激可導致大鼠的血糖含量水平升高，血糖升高導致炎癥因子釋放增多、氧化應激加強，從而加重抑郁癥的癥狀；二甲雙胍是一種常見的Ⅱ型抗糖尿病藥，經過降低血糖、增加胰島素含量，聯合抗壞血酸減少氧化應激而發揮抗抑郁作用[6]。根據已有研究：50、75、100、150 mg/kg的二甲雙胍連續腹腔注射21 d[7]，100 mg/kg的二甲雙胍連續口服4周都能夠改善CUMS誘導的大鼠抑郁行為[8]，加上我們實驗室前期研究[9]，本實驗選擇采用100 mg/kg的劑量連續腹腔注射14d觀察二甲雙胍對CUMS誘導的抑郁行為的影響，結果顯示，二甲雙胍可以明顯改善大鼠的快感缺乏、絕望無助和焦慮不安等抑郁行為。

抑郁癥在當前被認為是神經系統疾病，隨著深入研究發現，二甲雙胍除了具有治療糖尿病的效應外，對神經系統疾病也有一定的保護效應，例如：在阿爾茨海默病中，二甲雙胍通過阻止PP2A與MID的結合，增加PP2A的生物活性，抑制MAPT磷酸化，減少NFTs形成；通過上調胰高血糖素生物活性，減低胰島素抵抗，抑制神經元損害，激活神經干細胞，改善大腦神經損傷，改善阿爾茨海默病的認知障礙[13]。在MPTP誘導的帕金森小鼠模型中，二甲雙胍可以抑制MPTP誘導的α突觸核蛋白的磷酸化，上調蛋白磷酸酶2A的甲基化，抑制黑質紋狀體路徑中的星形膠質細胞的激活，增加黑質中腦源性神經營養因子的表達水平；二甲雙胍還能激活AMPK，調節代謝能量分布，增加紋狀體多巴胺含量，抑制小膠質細胞過度活化誘導的神經炎癥，減輕MPP誘導的細胞毒性，減少神經元死亡，對MPTP誘導的帕金森小鼠發揮治療作用[14]。二甲雙胍被FDA認可是能夠促進神經再生優化的藥物，不僅可以促進神經干細胞的增殖，還能促進神經干細胞的分化，因此能夠減少缺血性腦卒中的梗死區域并促進其恢復[15]。我們實驗室前期研究也發現，二甲雙胍對高原低氧誘導的認知損傷具有保護效應[9]，其作用機制可能與修復高原低氧誘導的海馬形態結構紊亂有關。

綜上所述，二甲雙胍能夠改善CUMS誘導的抑郁行為，其機制可能與修復受損的海馬結構有關，其具體的作用機制有待進一步的深入研究。