蘋果多酚對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管重構的作用和機制*

章書豪， 邵思銘， 陳方政， 祝 靜， 陳羅薇, 王 恒, 項歆惠， 袁琳波

(1. 溫州醫科大學第一臨床醫學院， 2. 溫州醫科大學仁濟學院， 3. 溫州醫科大學眼視光學院， 4. 溫州醫科大學基礎醫學院生理教研室， 浙江 溫州 325000 )

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類以肺動脈壓力進行性升高為特點的致命性肺血管疾病，嚴重的限制了患者的運動耐受性，且可能會發展為心力衰竭、慢性阻塞性肺病等多種心肺疾病[1-2]。肺動脈高壓的形成主要和肺血管收縮和重構有關，但是具體發生機制目前仍不清楚[3]。有研究發現，在肺動脈高壓中細胞受到炎癥刺激，COX-2的含量上升,引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量增加，導致肺動脈血管炎癥反應和組織損傷[4]。在肺動脈高壓中使用COX-2抑制劑和下調前列腺素，能夠調控血管內細胞活性[5]，因此COX-2可以作為多種抗炎癥藥物靶點。

蘋果多酚(apple polyphenol，APP)是從蘋果中提取的次生植物代謝產物，能通過ros/MAPK/NF-κB通路在抗氧化和抗炎癥中發揮重要作用[6]。在心血管疾病研究中發現,蘋果多酚能夠起到緩解動脈粥樣硬化[7]，激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS)，從而改善內皮細胞效應，降低肺部血壓[8]。但是目前鮮有研究其在肺動脈高壓的作用。在我們的研究中，發現蘋果多酚有助于緩解炎癥反應、血管收縮和平滑肌細胞的增殖作用，從而能夠改善肺動脈高壓。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

蘋果多酚購自上海源葉生物科技有限公司，野百合堿(MCT)購自上海同田生物技術股份有限公司。COX-2抗體購自英國Abcam公司, eNOS抗體和Abcam購自Cell Signaling Technology(Danvers, MA,USA)，PowerLab 4/35(澳大利亞AD Instruments)，生理壓力傳感器(BL—Newcentmry,成都泰盟科技有限公司)，CO檢測器(ml313C, AD儀器)，NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物分組與處理

實驗采用雄性SD大鼠，體重(180～200 g)，由溫州醫科大學實驗動物中心提供(20140038)。購入后普通飼料適應性喂養一周，飼養間溫度22～25℃, 相對濕度50%～60%。本實驗嚴格遵循美國國立衛生研究院所制定的《實驗動物使用指南》，實驗方案經過溫州醫科大學動物倫理學會審批。大鼠采用隨機編號分為四組(Con組，MCT組，APP組，MCT+APP組)，每組9只(1)Con組：大鼠皮下注射生理鹽水，作為對照組。(2)APP組：隔天按20 mg/kg的劑量腹腔注射蘋果多酚。(3)MCT組：按60 mg/kg劑量皮下注射MCT。(4)MCT+APP組：皮下注射60 mg/kg劑量MCT,隔天按20 mg/kg劑量腹腔注射APP，所有處理持續3周[9]。

1.3 大鼠體重與3周存活率的測定

各組大鼠于處理前和處理后一周、兩周、三周時分別進行稱重，并統計3周后各組存活大鼠數量，計算存活率。

1.4 肺動脈動力學測量

處理三周后，大鼠用3 ml/1 kg的水合氯醛麻醉，暴露右頸外靜脈，行頸外靜脈插管術，連接血壓壓力換能器至powerlab生物信號采集分析系統，對肺動脈壓力(mean pulmonary artery pressure，mPAP)進行讀值。用熱稀釋法檢測心輸出量(cardiac output, CO)，用CO檢測器(ml313C, AD儀器)處理數據。PVR用公式計算:PVR=mPAP/CO

1.5 右心室肥厚指數測量

大鼠處死解剖，將心臟沿著心室邊緣和室間隔將右心室切開。用生理鹽水略洗，除去多余心肌組織，用濾紙吸干其表面水分，稱量右心室、左心室、室間隔(left ventricle+ Interventricular septum, LV+S)的重量，右心室肥大指數計算公式:RV /(LV + S)×100%。

1.6 肺血管結構和形態的組織病理學觀察

將大鼠肺組織脫水透明，浸蠟包埋，65℃烘箱中烘干，二甲苯中脫蠟兩次，在濃度分別為100%、95% 、90%、80%、70%的酒精中依次浸泡3 min，再經蒸餾水轉入蘇木精染色。通過1%鹽酸乙醇進行分化。再將切片用伊紅染色并用蒸餾水洗滌后用70%，85%，95%，100%濃度梯度的乙醇脫水。二甲苯透明化后用中性膠固定。在光學顯微鏡下觀察肺血管結構和形態，以評估組織病理學變化。

1.7 肺動脈血管環外周長比值(WT%)，肺小血管管壁面積和管總面積比值(WA%)測量

采用病理圖像分析軟件 Image-pro Plus，測量肺動脈外徑(the diameter of external vessal, ED)，內徑(the diameter of internal vessal, ID)和內側壁厚度(medial wall thickness, MWT)。 肺動脈介質厚度(pulmonary arterial media thickness, PAMT)可以通過以下公式計算：PAMT = 2×MWT / ED，計算壁面積(WA)，總面積(total area, TA)，血管內腔面積(lumen area, LA)。計算WT%公式：WT%= 2×PAMT / ED×100%，計算WA%公式：WA%=(TA-LA)/ TA×100%。

1.8 通過Q-PCR檢測基因表達

將各組肺組織樣品剪成小塊后碾磨，加入TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離出全部RNA。使用GoScript逆轉錄試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)將RNA用作模板以產生cDNA合成。用于RT-PCR的引物序列如表1：

Tab. 1 The primer sequences used for RT-PCR

對于每個樣品，三次進行RT-PCR實驗。通過瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產量。

1.9 蛋白質印跡檢測COX-2和eNOS水平

通過10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，切除肺組織。分離肺主動脈，剪開動脈，內膜面貼于培養皿置37℃、5%CO2培養箱0.5 h后加含15%胎牛血清的培養液培養，第5日內皮細胞爬出后摘掉除組織塊，取內皮細胞放入EP管中，研磨后加入200 μl細胞裂解液，再次研磨置于離心機中14 000g離心15 min，收集上清液。酶標儀檢測蛋白質濃度，加上樣緩沖液煮沸保存。制備SDS-PAGE凝膠。通過10%SDS-PAGE分離蛋白質并轉移至PVDF膜。在通過多克隆抗COX-2(或抗eNOS)檢測COX-2(或eNOS)后，使用ECL成像系統顯示條紋灰度級來測量COX-2(或eNOS)的含量。

1.10 內皮細胞中NO水平檢測

內皮細胞分離方法同上，使用NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)來定量測定內皮細胞內NO水平，所有測量均遵循制造商方案進行。

1.11 大鼠肺動脈平滑肌細胞培養與鑒定

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，分離肺組織中的肺動脈，在顯微鏡下剝離肺動脈內外膜，將肺動脈中膜剪為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于25 ml培養瓶中，在37℃、5%CO2培養箱孵育。每4～6 d更換培養液1次(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。16 d后細胞爬出，呈典型峰谷狀分布。經抗α-actin單克隆抗體免疫組化鑒定，為純度97%以上的肺動脈平滑肌細胞。經胰酶消化傳代培養，采用生長良好的4～7代細胞進行實驗。

1.12 平滑肌細胞內Ca2 +水平檢測

通過Becton Dickinson FACS Calibur流式細胞儀，用Ca2++(-)敏感性熒光染料Fluo-3 /乙酰氧基甲酯(Fluo-3 / AM)測定平滑肌細胞內Ca2+水平。使用PerkinElmer LS 55熒光分光光度計測定熒光值，每1分鐘激發和發射波長為488 nm和526 nm。使用以下等式，用fluo-3熒光強度計算平滑肌細胞內Ca2+：[Ca2+] i = Kd [(F-Fmin)/(F max -F)]，其中Kd=400 nmol/L。通過添加0.1%Triton X-100測定最大Fluo-3熒光強度(Fmax)，通過加入5 mmol/L EGTA抑制Fluo-3熒光測定最小熒光強度(Fmin)。F是在不添加Triton-X-100或EGTA的情況下測量的熒光值。

1.13 統計學處理

2 結果

2.1 APP對MCT誘導的PAH大鼠的體重和存活率的影響

在建模和治療的3周中，Con組，APP組和APP + MCT組的平均體重增加，而MCT組的平均體重明顯減少。在治療結束時，MCT組的平均值低于Con組，APP組和APP + MCT組。 MCT + APP組的存活率高于MCT組，Con組和APP組的100%存活率。結果表明APP能夠提高大鼠存活率和體重(表2)。

2.2 APP對MCT誘導的PAH大鼠肺血流動力學的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的mPAP和PVR顯著增加(P<0.05)，這意味著成功建立PAH模型。 與MCT組相比，MCT + APP組的mPAP和PVR顯著降低(P<0.05)，顯示APP在治療MCT誘導的PAH大鼠有顯著作用。APP組與Con組結果相同，說明APP無明顯副作用(表3)。

2.3 APP對MCT誘導的PAH大鼠右心室重塑的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的RVHI顯著升高(P<0.05)。與MCT組相比，MCT + APP組的RVHI顯著降低(P<0.05)，表明APP對MCT誘導的PAH大鼠右心室肥大有抑制作用(表3)。

Tab. 2 Effects of APP on body weight and survival rate of MCT-induced PAH rats (g, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

GroupmPAPΔPVRRVHICon15.84±2.48213.37±30.290.17±0.03APP15.09±1.49212.93±27.980.16±0.03MCT56.49±7.71**698.68±80.69**0.50±0.09**APP+MCT39.53±8.85##498.59±115.32##0.35±0.10#

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

2.4 APP對MCT誘導的PAH大鼠肺動脈重構的影響

組織鏡檢結果顯示Con組和APP組肺動脈壁平滑且內皮細胞連續，平滑肌細胞無異常增厚現象，大多數肺泡壁完整。MCT組內皮細胞不連續，且有炎性細胞浸潤，肺動脈中層有10～15層的平滑肌，血管出現明顯增厚和重構現象。在MCT + APP組中，內皮細胞連續完整，動脈中層8～12層平滑肌APP治療緩解了MCT對肺組織的結構破壞，抑制了平滑肌細胞增厚(圖1A)。 MCT組的WT% (40.87%±7.58%)和WA%(82.00%±11.80%)顯著高于Con組的WT%(13.93%±3.00%)和WA%(59.00%±10.90%，P<0.05，圖1B和C)，MCT + APP組的WT%(25.36%±4.51%)和WA% (66.00%±10.90%)顯著低于MCT組(P<0.05，圖1B和C))，結果表明APP能夠緩解MCT誘導的血管重構。

2.5 APP對MCT誘導的PAH大鼠肺組織COX-2 和炎癥因子表達的影響

MCT組中MPO ,IL-1 ,IL-6 ,TNF-α表達顯著高于Con組和APP組中的炎性因子表達(P<0.05，圖2A，B和C)。 APP可緩解MCT引起的肺組織炎癥，因為MCT + APP組MPO ,IL-1,IL-6 ,TNF-α表達明顯低于MCT組(P<0.05，圖2A，B和 C)。MCT組的COX-2表達(3.483±0.671)顯著高于Con組中的表達，而MCT + APP組的COX-2表達(1.815± 0.215)顯著低于MCT組(P<0.05，圖2E)，結果表明APP能夠抑制炎癥反應。

Fig.1The effects of APP on the morphological and structural changes of pulmonary arterioles in the rats

A: Results of HE staining in rat lung tissue(× 200) ; B: Percentage of wall thickness to vascular diameter (WT%); C: Percentage of wall area to total vascular area (WA%).n=9

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

Fig.2The effects of APP on the expressions of MPO, IL-1, IL-6, TNF-α and COX-2 in the lung tissues(n=9)

A,B,C,D: Qrt-PCR results of MPO, IL-1, IL-6 and TNFα expressions in rats; E: Western blot results of COX-2 expression

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

2.6 APP對肺內皮細胞內eNOS表達及NO合成和肺動脈平滑肌細胞內Ca2 +濃度的影響

MCT組的肺內皮細胞NO合成水平(26.887±9.897)μmol/ L顯著低于Con組和APP組(55.777±9.823)μmol/ L(P<0.05，圖3A)。與MCT組相比，MCT + APP組肺內皮NO合成水平(42.161± 3.948)μmol/ L明顯升高(P<0.05，圖3A)。同時，四組eNOS表達量顯示出同樣的結果。MCT組的eNOS表達(0.234±0.0705)顯著低于Con組(P< 0.05，圖3B)，MCT + APP組(0.545±0.154)顯著高于MCT組(P<0.05，圖3B)。MCT刺激和APP治療也引起了四組細胞內Ca2 +濃度差異。MCT組的平滑肌細胞內Ca2 +濃度顯著高于Con組和APP組(P<0.05，圖3C和D)。與MCT組相比，MCT + APP組顯著降低(P<0.05，圖3C和D)。這些結果表明APP可以緩解MCT造成的內皮細胞eNOS表達下調的效應，同時可以降低肺動脈平滑肌細胞內Ca2+濃度。

Fig.3The effects of APP on the protein expression of eNOS and concentration of NO in endothelial cells and Ca2 +in pulmonary artery smooth muscle cells(n=9)

A: NO synthesis ofendothelial cells; B: eNOS expression of endothelial cells; C: The curves of intracellular Ca2+concentration varying along with time; D: Intracellular Ca2+concentration levels differed in pulmonary arterial smooth muscle cells

*P<0.05,**P<0.01vsCon group

3 討論

肺血管的收縮和重構是各種病理類型肺動脈高壓發生發展的共同環節[10]。目前研究認為炎癥反應會引起肺血管收縮和重構的產生。一方面炎癥因子的過度表達會改變平滑肌細胞內代謝通路關鍵酶的含量，誘導平滑肌細胞過度增殖，血管腔狹窄，導致肺血管阻力升高[11]。另一方面炎癥因子的釋放，白細胞的聚集誘導內皮損傷和凋亡，上調平滑肌細胞內Ca2 +[12]。胞漿內游離的Ca2 +[(Ca2 +)i]是肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)收縮，分化和增殖的關鍵作用因子，Ca2 +上調會導致血管重構的發生[13]，兩者相互作用導致肺動脈高壓的形成。同時，COX-2作為COX家族的同工酶，其在正常細胞中的含量極低。但在炎癥因子的刺激下，COX-2會過度表達并上調炎癥反應中關鍵酶含量和活性。因此COX-2是炎癥反應中的關鍵指標[14]。COX-2也被認為是抗炎藥物的治療靶點[15]。

蘋果多酚是一種提取自蘋果的多酚類物質，以往研究發現其具有很強的抗炎活性[15]。在我們的實驗中，發現蘋果多酚不僅可以通過抑制炎癥因子COX-2和IL-1，IL-6，TNF-α，MPO 的表達，減輕炎癥反應和血管壁內白細胞聚集。還可以通過促進內皮細胞合成eNOS，釋放NO，起到緩解血管收縮和保護內皮細胞的作用。保持血管壁內皮細胞的完整，能夠通過內皮細胞和平滑肌細胞，胞間信號傳導降低平滑肌細胞內Ca2 +含量，抑制平滑肌細胞增殖，從而逆轉肺血管重構，改善血液動力學指標。此外，還有實驗發現，蘋果多酚能夠通過NF-κB通路減輕內皮細胞炎癥反應[16]，介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路促進細胞凋亡，于在心血管疾病中，蘋果多酚還能夠通過抑制ox-LDL誘導MAPK的激活預防早期動脈粥樣硬化[17]。

我們的研究發現蘋果多酚主要通過調節炎癥因子表達和細胞內NO和Ca2 +，保護內皮細胞，抑制平滑肌細胞增殖，來逆轉肺血管重構過程，并且沒有副作用。目前還有研究指出蘋果多酚能夠通過代謝途徑和其他炎癥通路，抑制肺平滑肌細胞增殖，但具體機制尚不清楚，仍有待研究。但其是天然植物提取物，易提取純化，且無明顯毒副作用，具有良好的廣泛應用前景。