超聲造影定量分析評價膿毒血癥兔致急性腎損傷腎功能狀態的研究

孫己晶 ，張兆光 ，陳學勛 ，王翠花 ，馬桂鳳 ，趙榮榮 ，羅倩 ，郭民

1.濰坊醫學院，山東濰坊 261000；2.濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊 261041

膿毒血癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征，嚴重者可引起膿毒癥休克，甚至多器官功能衰竭。急性腎衰竭是危重癥患者常見的并發癥，其病死率高于其他原因引起的急性腎衰竭。因此，早期識別急性腎損傷，盡早干預可明顯降低其死亡率。該文旨在探討超聲造影技術在急性腎損傷早期腎功能評價中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器

iU22彩色多普勒超聲顯像儀，超聲造影劑Sono Vue,自動生化分析儀，ELISA試劑盒。

1.2 動物模型制備

健康新西蘭白兔20只，雄、雌各10只，體重1.5～2.5 kg，適應性喂養1周，實驗前禁食12 h，手術組采用CLP復制膿毒血癥AKI模型，即用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，無菌條件下沿腹中線切開長約2 cm，分離、結扎盲腸，在盲端腸壁用12號針穿刺2次，留置1條長1 cm寬2 mm、兩頭貫穿盲腸的橡皮片，擠出少許糞便，將盲腸還納，逐層縫合腹壁，編號，清醒后轉入代謝籠內自由進水、進食。術畢補充生理鹽水3 mL/100 g，術后自由飲水，并給予抗生素及相應支持治療。28只存活超過12 h。

1.3 留取標本

從術后腹壁縫合結束開始計時，分別于0、2、4、6、12 h為觀察點，下腔靜脈抽血5 mL，離心（3 000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，采用生化分析儀待測Scr、BUN；膀胱分離，膀胱穿刺收集尿標本于-20℃保存，采用 ELISA 法待測 KIM-1、IL-8、NGAL；后隨機處死一只兔子，取左腎切開置于10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下×200下取3個視野觀察腎臟病理變化。

1.4 超聲造影檢查方式

經兔耳緣靜脈注入超聲造影劑混懸液，每次劑量為0.2 mL，隨后注入2 mL生理鹽水。同時啟動圖像采集，觀察140S內腎實質回聲變化,用隨機定量分析軟件對感興趣區域進行動態分析研究，檢查結束后，在機曲線擬和,獲得腎灌注時間-密度曲線及一系列灌注參數，使用DICOM格式記錄各個時間點的數據。

1.5 統計方法

使用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行t檢驗，對所有連續變量進行分布正態性檢驗，組間比較SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔腎功能的變化

CLP 術后 6 h，膿毒血癥兔尿 KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h開始顯著升高，12 h更高，均顯著高于建模前（P＜0.05）。 建模后 12 h，膿毒血癥兔 Scr、Urea 的濃度顯著升高，均明顯著高于建模前（P＜0.05）。

2.2 兔腎臟病理改變

HE染色光鏡下，建模前腎小球、腎小管結構正常；模型組6 h開始出現炎性損傷，以12 h為著，表現為彌漫性單核-巨核細胞浸潤，組織間隙水腫，腎小管上皮細胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現裸膜，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴張，管型形成。

表1 建模前及建模后不同時間點腎功能指標的變化情況（±s）

表1 建模前及建模后不同時間點腎功能指標的變化情況（±s）

注:與建模前同側腎臟比較，aP<0.05。

指標0 h 2 h 4 h 6 h 12 h Scr（μmol/L）Urea（mmol/L）KIM-1（ng/L）NGAL（μg/mL）IL-18（pg/mL）50.2±7.8 3.35±1.72 1.19±0.14 0.56±0.11 58.32±18.53 65.31±10.82 5.22±3.01 1.21±0.07 0.73±0.39 62.64±20.41 70.42±13.25 8.25±4.01 1.41±0.16 1.10±0.76 70.46±21.45 72.38±10.8 9.02±5.01（2.54±0.77）a（2.40±0.99）a（96.95±23.47）a（102.18±14.91）a（13.54±3.11）a（3.92±0.23）a（3.19±0.87）a（117.61±38.0）a

表2 建模前后各時間點腎皮質各項灌注參數比較（±s）

表2 建模前后各時間點腎皮質各項灌注參數比較（±s）

注：與建模前同側腎臟比較，aP<0.05，bP<0.01。

指標 部位0 h 2 h 4 h AUC（dB·s）TTP（t/s）DPI（dB）A（dB·s）α（dB·s）左腎右腎左腎右腎左腎右腎左腎右腎左腎右腎135.6±68.4 129.5±64.8 6.3±3.7 6.2±3.5 6.1±3.5 5.9±3.8 3.2±1.5 3.1±1.8 0.19±0.15 0.17±0.14 169.2±78.4 172.6±76.7 8.3±5.6 8.5±4.9 5.9±4.2 5.8±4.0 3.0±1.5 2.9±1.3 0.14±0.18 0.15±0.15（279.2±55.5）a（277.6±58.4）a（10.5±4.9）a（11.1±6.3）a 5.5±3.2 5.6±3.5（2.2±1.5）a（2.4±1.6）a（0.09±0.03）a（0.09±0.02）a 6 h 12 h（289.2±62.3）a（269.7±68.5）a（13.5±5.7）a（13.8±5.3）a（4.3±3.0）a（4.1±3.3）a（2.0±1.4）a（2.1±1.7）a（0.06±0.04）a（0.07±0.05）a（309.2±78.8）b（310.7±80.4）b（16.7±7.6）b（15.9±7.1）b（4.0±3.2）a（4.0±3.5）a（1.8±0.8）b（1.9±0.7）b（0.04±0.02）b（0.04±0.02）b

2.3 腎皮質灌注實時觀察及參數分析

團注超聲造影劑后，觀察到腎臟由腎動脈、腎皮質、腎髓質的順序依次明顯增強，隨后逐漸消退。建模后4 h左右腎的腎皮質AUC較建模前顯著增大 （P<0.05），TTP 較建模前顯著延長 （P<0.05），α、A 均顯著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更著（P＜0.01），DPI于建模后6、12 h顯著低于建模前（P<0.05），而兩腎各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒血癥時，腎臟內皮細胞不僅被激活，產生炎癥因子，同時也是炎癥因子首要攻擊的靶細胞之一，從而導致腎臟灌注減少，造成腎臟損傷[1-2]。因此，及早發現并防治膿毒血癥并發急性腎損傷，保護腎功能意義重大。

目前對于AKI的功能檢測，通常采用Scr、BUN來評價[3]，但臨床上，GFR下降到正常的1/3時，Scr開始上升；GFR下降到正常的50%以下時，BUN開始上升[4]。一旦疾病診斷成立時，腎功能往往已到了不可挽回的地步，而且Scr、BUN受年齡、性別、藥物、肌肉代謝及操作方法等多因素影響，因此，并不是AKI早期評價腎功能最理想的方法。腎臟組織活檢是確定腎臟病理改變的唯一方法，但其屬有創性檢查，具有一定的風險，且患者依從性較差。通過復習相關文獻，篩選出可能在膿毒血癥致AKI早期發生特異性改變的尿液的生物學標記物，如 NGAL、KIM-1、IL-8，測定這些生物學標記物在膿毒血癥發生后的水平，可早期發現腎功能的損害，與傳統意義的血肌酐、尿素氮相比，是更早期的敏感指標，但這些標記物同樣受限于尿標本的采集和檢驗的局限性。該實驗發現：CLP術后，膿毒血癥兔尿KIM-L、NGAL、IL-18均于6 h開始顯著升高，12 h更高，均顯著高于建模前，差異有統計學意義（P<0.05）。 建模后 12 h，膿毒血癥兔 Scr、Urea 的濃度顯著升高，均明顯著高于建模前，差異有統計學意義（P<0.05）。 表 1 可見，KIM-L、NGAL、IL-18 是較 Scr、Urea更能早期反映腎功能狀態的指標。

超聲造影作為一種全新血流成像模式，更敏感、精確地顯示急性腎損傷早期腎臟血流灌注狀態的改變，尤其是對微小血管可提供更敏感、真實的血流信息，為臨床早期診斷急性腎損傷提供了新途徑[5]。腎皮質灌注的實時觀察及灌注參數分析：經肘靜脈團注超聲造影劑后，可以觀察到沿腎動脈、腎皮質、腎髓質顯影依次明顯增強，隨后逐漸消退。隨著腎臟病情不斷進展，各超聲造影灌注參數值在不同時期均發生顯著變化。Dong等[6]、Wang等[7]的研究同樣表明超聲造影技術通過TIC曲線各灌注參數的變化來監測患者腎功能狀態的改變。如表2所示：建模后4 h左右腎的腎皮質曲線下面積 （279.2±55.5）dB·s 較建模前（135.6±68.4）dB·s 顯著增大 （P<0.05）， 達峰時間（10.5±4.9）t/s 較建模前 （6.3±3.7）t/s 顯著延長 （P<0.05），另外，下降斜率（α）、上升斜率（A）均顯著低于建模前（P<0.05），6、12 h 更為顯著（P<0.01），達峰絕對值（DPI）于建模后 6 h、12 h 顯著低于建模前（P<0.05），而兩腎各時間點比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。通過對腎皮質血流灌注的實時動態監測，超聲造影技術能夠準確顯示膿毒血癥兔急性腎損傷早期血流動力學變化，于4 h后就發生顯著改變。該實驗結果表明，在兔AKI早期，超聲造影灌注參數值較血肌酐、尿素氮更敏感、精確，與毛世杰[8]等研究結果一致，且早于較敏感的尿KIM-L、NGAL、IL-18，而且隨著腎功能的下降，測定參數也隨之變化。

該研究建立比較完善的膿毒血癥腎功能損害的動物模型，應用超聲造影定量分析技術對動物腎臟的血流灌注、腎功能狀態進行分析，為臨床早期判斷膿毒血癥腎功能狀況提供一種新的手段。同時，可以作為AKI保守治療有效的監測工具和手段[9]。