阿維菌素納米乳劑的研制及其檢測

穆永才 羅天瑤

摘要：為了研制成阿維菌素納米乳制劑，篩選出由油酸乙酯、吐溫80、1，2-丙二醇、純水組成的空白納米乳體系。經溶解試驗，該體系對阿維菌素的溶解性良好，可達1.6%以上。選取1%的阿維菌素納米乳劑，進行質量和安全性評價，結果表明：這種阿維菌素納米乳劑理化指標合格，無刺激性、無過敏性、無溶血性，穩定，安全可靠。

關鍵詞：納米乳;阿維菌素;新劑型;研制;檢測

中圖分類號：S859.5 ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：2095-9737（2019）03-0001-04

阿維菌素是大環內酯類抗生素，具有結構新穎、農畜兩用的特點。目前，在市場上銷售的阿維菌素原藥是以abamectin為主要殺蟲成分，并以B1a的含量來標定[1]。這種抗生素在獸醫臨床上主要用于畜禽的消化道線蟲和外寄生蟲的驅殺。常用的劑型有粉劑和注射劑等。這些劑型一度滿足防治畜禽相應寄生蟲的需求，但也存在著持效期短、需多次給藥、藥效不穩定等缺點。納米乳劑是由油相、水相、乳化劑和助乳化劑組成的相對穩定體系，制成藥劑具有生物活性高、緩釋、刺激性小、毒性低、穩定的特點[2]。為了克服現有阿維菌素制劑的諸多不足，筆者研制成一種阿維菌素納米乳制劑，并對其特性進行測定，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器設備

激光粒度儀（winner802型），由濟南微納顆粒儀器股份有限公司生產;運動黏度自動測定儀（ZTND2000型），由上海平軒科學儀器有限公司生產;電導率儀（DDSJ-318型），由上海儀電科學儀器股份有限公司生產;恒溫磁力攪拌器（S10-2型），由上海司樂儀器有限公司出品;ZYP-320偏光顯微鏡，上海兆儀光電有限公司生產，HT7700透射電鏡，日本日立公司生產;MiniSpan Plus微型高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司生產;WAY-2W阿貝折射儀，上海精科實業有限公司生產;LC-20AT液相色譜儀，日本島津公司生產;FAT2104電子天平，常州萬得天平儀器有限公司生產。BR120-4固液比重計，百榮精密儀器有限公司生產。

1.2 主要試劑

阿維菌素原藥（B1≥90%），大慶志飛生物化工有限公司生產;油酸乙酯、乙酸乙酯，江西阿爾法高科藥業有限公司生產;聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40），德國巴斯夫公司（BASF）生產;Transcutol.V（二乙二醇單乙基醚獸用型），法國嘉法獅公司（Gattefossé）生產;吐溫80、1，2-丙二醇、正丁醇、無水乙醇，天津富宇精細化工有限公司生產;色譜甲醇，購自天津賽孚瑞科技有限公司;阿維菌素色譜標準樣品，沈陽化工研究院生產。純化水，檢驗研究室自制。

1.3 實驗動物

健康狀況良好的成年大耳白兔4只，雌雄各半，購于富?？h華美養兔場;體重50 kg綿羊20只購自于齊齊哈市北郊養羊戶。這些實驗動物均為舍飼，自由采食，自由飲水，實驗前進行臨床健康觀察。

2 方法

2.1 阿維菌素納米乳劑的制備

2.1.1 增溶體系的選擇

以各組分均為醫藥級產品、對阿維菌素增溶能力強、形成穩定的納米乳劑為標準，進行增溶體系的選擇。預選的體系有油酸乙酯、水、聚氧乙烯氫化蓖麻油、二乙二醇單乙基醚體系[2]，油酸乙酯、水、吐溫80、1，2-丙二醇體系[3]，乙酸乙酯、水、吐溫80、無水乙醇體系[4]，油酸乙酯、水、吐溫80、正丁醇體系[5]。

篩選方法采取2種方式。方式1是將每個預選體系的油相、乳化劑、助乳化劑及主藥按一定質量依次混合后，再逐滴加入水相，觀察體系狀態。油相與總表面活性劑的比例分別是1∶9;1∶8;1∶7;1∶6;1∶5;1∶4。乳化劑與助乳化劑的比例（Kim值）分別為3∶1;2.5∶1;2∶1;1∶1。方式2是預先將油相與主藥混合制成油藥溶液?；旌系拇涡蚴侨榛瘎?、助乳化劑、油藥溶液。逐滴加水，觀察體系狀態。油藥與總表面活性的比例和乳化劑與助乳化劑的比例（Kim值）同方式1。采用以上兩種方式在4種體系中篩選出油酸乙酯、水、吐溫80、1，2-丙二醇體系為最佳增溶體系。經反復多次試驗，形成濃度高達1.6%以上阿維菌素納米乳。

2.1.2 1%阿維菌素納米乳的制備

稱取21.50%的乳化劑于制藥燒杯底部，再稱取8.68%的助乳化劑置于乳化劑之上，然后再稱取3.77%的油藥溶液置于助乳比劑之上。將轉子和溫度探頭置于制藥燒杯內，設定轉數為120 r/min，溫度為35℃，開啟磁力攪拌器開關。邊攪拌，邊逐滴加入純化水，滴水速度控制在60滴/min，當加入水量達到66.05%時，關閉滴定管閥門，停止滴水，繼續攪拌至溶液透明為止。

將上述藥液過濾除菌后，分裝于高溫干燥滅菌的青霉素瓶中，用于各項檢測之用。

2.2 納米乳劑的檢測

2.2.1 理化性質的檢測

2.2.1.1 粒度檢測

使用光相關納米粒度儀進行檢測。測試條件：分散介質為水，折射率為1.333，粘度為8.904E-04Pa.S，測試溫度為25℃，延遲單位時間是25μs。

2.2.1.2 納米乳類型檢測

采取如下兩種方法[6]：①稀釋法，將少量的乳狀液分別加入油和水中輕輕搖動，看乳狀液在油中還是在水中容易分散。當乳狀液加入油中容易分散，則油為連續相，說明乳狀液為W/O型;當乳狀液加入水中容易分散時，則水為連續相，乳狀液為O/W型。②濾紙法，將一滴乳狀液滴于濾紙的中心，如果乳狀液為O/W，即水為連續相時，水容易在濾紙上通過毛細作用而向外擴散，最終在濾紙的中心剩余1個小油點。但如果是W/O型乳狀液時，乳狀液幾乎在濾紙上不擴散。

2.2.1.3 粘度檢測

采用運動粘度測定儀進行檢測。測試前參數設置：樣品號碼：0001#，當前粘度計1#，1#粘度計系數為0.8，預置溫度25℃，溫度微調-0.5℃，打開自動控溫，開啟打印，設置好日期和時間。將藥劑按要求吸入毛細管粘度計內，并將毛細管粘度計置于恒溫槽中，即可檢測，每樣品檢測3次，取其均值。

2.2.1.4 密度檢測

選用固液比重計進行檢測。用100 g標碼進行校正，設定常用參數，選擇測量模式，按照液體比重測量的操作方法進行。

2.2.1.5 電導率檢測

開機后在儀器的起始狀態進行設置操作。在測量模式中勾選電導率選項和連續測量模式;在系統設置中進行操作編號;在設置電導常數中設置與電導電極上標注的同樣的電導常數。按要求安裝好電導電極以及溫度傳感器，準備好待測溶液后，即可開始測量。

2.2.1.6 雙折射現象檢測

采取偏光顯微鏡法檢測。經過調節亮度、調焦、調整載物臺和物鏡中心重合、孔徑光闌中心調節、正交偏光觀察等幾個步聚，觀察被檢樣品有無雙折射現象的發生。

2.2.1.7 pH值檢測

采用pH計法測定。準備：按使用說明進行相關準備，儀器標定：打開電源開關，儀器進入pH測量狀態。調節溫度使溫度顯示值和溶液溫度一致。按“標定”鍵，任選兩種標定液進行標定。測量：用蒸餾水及被測溶液清洗電極后即可對被測液進行測量。

2.2.1.8 穩定性檢測

采取了恒溫儲存試驗。即將藥品試樣分別儲存在高溫（40℃）和常溫（20～25℃）的環境中，隨時觀察藥樣的外觀變化，并按一定時間間隔進行藥樣粒度和主藥含量檢測。

2.2.2 阿維菌素含量的測定

采用液相色譜分析方法。色譜條件：高效液相色譜儀（具有紫外可變波長檢測器）;色譜柱：150 mm×3.9 mm（id）不銹鋼柱，內裝Nova-PakC18、5 μs填充物;流動相：甲醇+乙腈+水=38+38+24，經過濾、脫氣處理;流量控制在1.0 mL/min;柱溫：置室溫下，其溫差變化不能大于2℃;檢測波長：245 nm;進樣體積：5 μL;保留時間：B1a 15.6 min，B1b 11.3 min。

2.2.3 納米乳劑的溶血試驗

按有關文獻[7]介紹的方法進行。首先制成2%兔紅細胞懸液。再用生理鹽水對1%阿維菌素納米乳制劑進行稀釋（稀釋比為1∶3）后當作供試藥液。然后取7支10 mL試管，分別編號為1～7號，將1～5號管作為試樣品管，將6號管作為陰性對照管，將7號管作為陽性對照管。各試管加樣種類、次序及加樣量見表1。

按上表依次加樣，混勻后置37℃恒溫箱中溫育。記錄0.25 h，0.5 h，1 h，2 h，3 h的結果。當陰性對照管（凝聚和無溶血發生）和陽性對照管（有溶血）條件成立的情況下，在3 h內，如果試樣管中的溶液不發生凝聚和溶血，則受試藥液可以注射使用;若試樣管中的溶液發生凝聚和（或）溶血，則受試藥液不宜注射使用。

2.2.4 納米乳劑對家兔的刺激性試驗

遵循有關文獻[8]進行。利用白兔背部皮膚脫毛處理后，分成左右、前后四區。將生理鹽水和伊維菌素微乳制劑一次性涂抹于指定的皮膚區域，劑量均為0.5 mL.觀察皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應，根據制定的“皮膚刺激反應評分標準”和“皮膚刺激強度評價標準”評定藥物對家兔皮膚的刺激性。同時將受試物滴于家兔眼結膜囊內，觀察虹膜、角膜和結膜是否出現渾濁、充血、水腫等局部反應，依據“眼刺激試驗評分標準”和“眼刺激程度評價標準”評價藥物對家兔眼睛的刺激性。

2.2.5 對靶動物綿羊的安全性試驗

將20只綿羊隨機分成4組，設1倍量、3倍量、5倍量、空白對照、處理，每組的給藥劑量分別為0 mg/kg、0.2 mg/kg、0.6 mg/kg、1.0 mg/kg體重肌注給藥，二次用藥24 h后，于靜脈采血進行血液生化和血液學的檢測，以及病理學檢查。整個試驗期間每天定時觀察試驗羊的精神、飲食和臨床癥狀的改變并記錄死亡情況。

3 試驗結果

3.1 理化性質檢測結果（見表2）

3.2 穩定性檢測結果（見表3）

3.3 溶血試驗結果

在試驗觀察期內，陽性對照組可見完全溶血現象，其他各組未見溶血和凝集現象的發生，說明1%阿維菌素納米乳注射液可供注射使用。

3.4 刺激性試驗結果

破損皮膚試驗區24 h后已無刺激性，完整試驗區30 min后無刺激性。對照組破損皮膚試驗區在去除受試物30 min后對皮膚無刺激性。根據評分標準將該注射液對皮膚的刺激性定為無刺激。

受試兔雙眼角膜、結膜、虹膜均正常。該注射液對家兔的眼部無明顯影響。依據眼的刺激反應評分統計結果判定該制劑對家兔眼睛無刺激性。

3.5 安全性試驗結果

整個試驗期內，試驗、對照各組羊健康狀況良好，精神、飲水、采食未見異常。無中毒和死亡的現象發生。

血液、生化及病理學檢測結果表明，1%阿維菌素納米乳注射液對羊的血細胞生成無不良影響，對羊的肝、腎功能和各物質代謝均無不良影響，未發現各組羊的實質器官有異常和可疑的病變。

4 討論與分析

阿維菌素已廣泛應用于農業和畜牧業病蟲害的防治。在獸醫臨床上主要用于畜禽消化道線蟲和體外寄生蟲的驅殺。對于如此重要的抗寄生蟲病藥物新劑型的研究和探索一直是業內人士的熱點課題。目前的研究和生產實踐表明，用于防治植物病蟲害的阿維菌素納米乳劑已有市售。在防治畜禽寄生蟲病方面，獸用伊維菌素納米乳的研制已有報道[2]，但獸用阿維菌素納米乳劑尚未見報道。伊維菌素與阿維菌素，雖為同類藥物，結構相似，藥效相同，但阿維菌素的價格較伊維菌素低。本項研究的難點主要在于對阿維菌素溶解性好、穩定、毒性低或無毒的納米乳基質的研制及生產工藝的建立。

在研制過程中，結合國內外已有報導和多年從事納米乳獸藥研究經驗，在四種醫用納米乳基質中，篩選出油酸乙酯、吐溫80、1，2-丙二醇、純水為組分的阿維菌素納米乳增溶體系。經特殊工藝處理后，對阿維菌素的增溶濃度可達到1.6%以上，此濃度高于常規注射劑（1%），加之納米乳劑具有微量高效的特性，因此完全滿足臨床需求。研制的另一個難點是納米乳劑主藥濃度的測定。為了使B1a和B1b與雜質完全分離，項目組經多次試驗發現以38%乙腈、38%甲醇與24%純水（均為體積百分比）組成流動相，可以解決這一問題。這種定量方法簡便可行，準確度和精密度較好。

按照《中國獸藥典》[9]、《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[10]，參考有關文獻方法進行了1%阿維菌素納米乳劑理化性質、安全性以及刺激性、過敏性和溶血性的試驗。結果表明，該制劑穩定（穩定期在2年以上），理化指標符合相關規定，對靶動物安全，無刺激性、過敏性和溶血性。

上述試驗結果為該制劑的臨床應用打下了良好的基礎。

參考文獻：

[1] 鄒磊，張玉華.阿維菌素的發展趨勢展望[J].黑龍江醫藥，2006，19（3）：200.

[2] 羅天瑤，穆永才，蘭世捷.伊維菌素納米乳劑的研制及其評價[J].黑龍江畜牧獸醫，2017（12）：156-158，296.

[3] 張繼瑜，李劍勇，周緒正，等.一種伊維菌素納米乳藥物組合物及其制備方法：中國，2008101503549[P].2010-01-13.

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[5] 劉根新，張繼瑜，吳培星，等.伊維菌素納米乳注射液的研制與質量安全性評價[J].畜牧獸醫學報，2011，42（8）：1161-1167.

[6] 王軍，楊許召.乳化與微乳化技術[M].1版.北京：化學工業出版社，2012.

[7] 邢守葉，周緒正，李冰，等.伊維菌素微乳制劑的溶血性試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（6）：98-99.

[8] 劉磊，張繼瑜，周緒正，等.伊維菌素微乳劑的家兔刺激性試驗[J].江蘇農業科學，2013，8：197-199.

[9] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2015年1部）[M].北京：中國農業出版社，2016.

[10] 中華人民共和國衛生部藥政局.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則[M].2005：208-209.