國產卡泊芬凈對曲霉菌的體外活性評估

于淑穎 張麗 李穎 徐英春

(1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730；2.中國醫學科學院北京協和醫學院，北京 100730)

隨著罹患自身免疫病、艾滋病、腫瘤等惡性疾病患者數量的不斷增多，侵襲性曲霉病在臨床的發病率也逐年升高[1]。根據2008年美國感染病協會(IDSA)公布的曲霉病治療指南，對于侵襲性肺曲霉病，尤其是威脅生命的嚴重感染，首選唑類抗真菌藥物。但是隨著唑類抗真菌藥物的推廣應用，曲霉對其耐藥的報道逐漸增多，且曲霉對氟康唑和酮康唑呈現天然耐藥[2]。

卡泊芬凈(caspofungin)是新型棘白菌素類抗真菌藥物，通過非競爭性抑制1,3-β-D葡聚糖的合成、破壞真菌細胞壁的完整性來發揮抗真菌作用。2001年，卡泊芬凈(默沙東公司，商品名科賽斯)獲得了美國食品藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMA)的許可，全球范圍內用于念珠菌病、不明原因的中性粒細胞減少性發熱患者的經驗性抗真菌治療和(脂質體)兩性霉素B和(或)伊曲康唑治療無效或不能耐受的侵襲性曲霉病[3]?？ú捶覂魧η咕鷮?包括煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構巢曲霉、土曲霉和白曲霉)具有很好的體外活性[4]。

本研究就中國江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產仿制藥卡泊芬凈(商品名卡凈，以下稱國產卡泊芬凈)對侵襲性曲霉菌的體外抗真菌藥物敏感性，與進口卡泊芬凈(默沙東公司，商品名科賽斯，以下稱進口卡泊芬凈)進行對比，評估國產和進口卡泊芬凈體外抗真菌活性的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 本研究選取北京協和醫院2014-2016年呼吸道、血液、腹腔等部位分離的37株煙曲霉、15株黃曲霉、10株黑曲霉、5株土曲霉、4株構巢曲霉以及日本曲霉、塔賓曲霉、溜曲霉和聚多曲霉各1株，共計75株。

質控菌株 近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6528為標準菌株。

試劑與儀器 本研究所用藥物，國產卡泊芬凈(中國江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，商品名卡凈，0.5 g/瓶)，進口卡泊芬凈(美國默沙東公司，商品名科賽斯，0.5 g/瓶)，米卡芬凈(中國安斯泰來制藥有限公司，商品名米開民，0.5 g/瓶)，泊沙康唑(美國默沙東公司，商品名諾科飛，混懸液，5 mL：200 mg)；氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和兩性霉素B標準品從中國食品藥品檢定研究院購買?？岂R嘉顯色培養基(法國科馬嘉公司)；沙堡弱培養基(英國OXOID公司)；RPMI1640培養基，含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅為指示劑，使用0.165 mol/L MOPS緩沖液調pH7.0±0.1(德國sigma-aldrich公司)；無菌U型96孔板(江蘇省海門盛泰實驗器材廠)；全自動加樣儀器Sentititre AIM(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

VITEK MS 入組菌株采用VITEK MS進行鑒定，菌落均勻涂布在靶板上，滴加1μL基質，待干燥后放入機器采集峰圖，與數據庫中的峰圖比對得出鑒定結果及鑒定率，具體操作遵照儀器使用說明書?？尚哦却笥?0%，認為鑒定至種水平。

基因測序 通過鈣調蛋白基因擴增和測序進行進一步鑒定，所有菌株均鑒定至種的水平[1]。采用試劑盒純化方法，根據說明書提取曲霉菌DNA，將DNA產物送至北京睿博興科生物技術有限公司進行測序，測序結果在GenBank網站上進行比對。

藥敏試驗 嚴格按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)M38推薦的微量液基稀釋法[5]，平行測試卡泊芬凈(0.008～8 μg/mL)、國產卡泊芬凈(0.008～8 μg/mL)、米卡芬凈(0.008～8 μg/mL)、泊沙康唑(0.015～16 μg/mL)、伊曲康唑(0.015～16 μg/mL)、伏立康唑(0.015～16μg/mL)和兩性霉素B(0.015～16 μg/mL)。

數據分析 根據MEC/MIC值計算MEC/MIC范圍、MEC50/MIC50、MEC50/MIC90和幾何均數(GM)，結果判讀以CLSI M59推薦折點為判斷標準，米卡芬凈的結果判讀參照Li等研究者的推薦[6, 7]，比較兩種卡泊芬凈藥敏檢測結果間的一致性及8種抗菌藥物的抗菌活性。兩種卡泊芬凈的一致性通過分類一致性(極大錯誤、大錯誤和小錯誤的發生率)以及基本一致性進行評價。分類一致性(categorical agreement， CA)指待測藥物與參考藥物判讀結果的一致性，如二者均判讀為敏感、中介或耐藥[8]。實質一致性(essential agreement, EA)指被待測藥物檢測MIC值與參考藥物相差不超過1個稀釋倍數[9]。

2 結 果

2.1 菌種鑒定結果

以鈣調蛋白基因測序結果為“金標準”，VITEK MS的結果顯示無法鑒定出塔賓曲霉和溜曲霉，并將日本曲霉錯誤鑒定為黑曲霉，造成這種現象的原因是由于VITEK MS數據庫中不包含上述3種菌種。除此之外，VITEK MS將其余72株曲霉菌均正確鑒定至種水平。

2.2 7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗菌活性

表1顯示7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗真菌活性，總體來看，全部抗真菌藥物對絕大多數菌株具有較低的MIC或MEC值，棘白菌素類藥物的MEC值總體低于唑類藥物的MIC值，而米卡芬凈對全部曲霉菌株的MEC50和MEC90比卡泊芬凈低出2個梯度。唑類藥物中，伊曲康唑MIC50和MIC90(1 μg/mL和2 μg/mL)最高，高于伏立康唑(0.5 μg/mL和1 μg/mL)和泊沙康唑(0.12 μg/mL和0.5 μg/mL)。兩性霉素B對98.7%的菌株(74/75株)的MIC值≤2 μg/mL，只有1株黃曲霉的MIC值為4 μg/mL。

除了伊曲康唑(敏感率59.5%)，37株煙曲霉對其他抗真菌藥物的敏感率均高達100%。黃曲霉和黑曲霉中也觀察到類似的結果，15株黃曲霉和10株黑曲霉對伊曲康唑的敏感率分別為93.3%和60%。相較于其他菌種，兩性霉素B對黃曲霉的MIC值更高，MIC50和MIC90分別為2 μg/mL和4 μg/mL。綜合來看，國產卡泊芬凈和進口卡泊芬凈具有相同的MEC范圍、MEC50和MEC90。但是分菌種來看，國產卡泊芬凈對煙曲霉的MEC50(0.03 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(0.06 μg/mL)；國產卡泊芬凈對土曲霉的MEC90(≤0.008 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(0.015 μg/mL)；國產卡泊芬凈對其他不常見曲霉的MEC50和MEC90(均為0.015 μg/mL)低于進口卡泊芬凈(均為0.03 μg/mL)。

2.3 國產卡泊芬凈和進口卡泊芬凈藥敏測定結果間的一致性分析(見表2)

兩種卡泊芬凈對曲霉抗菌藥物敏感性結果的分類一致性和實質一致性均高達100%。國產卡泊芬凈和進口卡泊芬凈僅對11株曲霉菌的MEC值存在不一致，包括8株煙曲霉、1株黃曲霉、1株土曲霉和1株塔賓曲霉，且國產卡泊芬凈對上述菌株的MEC值僅較進口卡泊芬凈低一個濃度梯度?？傮w來說，兩種卡泊芬凈對曲霉菌體外藥敏測定結果高度一致。

表1 7種抗真菌藥物對75株曲霉臨床分離株的抗菌活性

(續表)

表2 兩種卡泊芬凈對75株曲霉菌的MEC值的比較以及一致性評價

2.4 棘白菌素類藥物24 h和48 h藥敏測定結果的一致性分析(見表3)

卡泊芬凈和米卡芬凈對超過76%的曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結果完全一致。48 h時，國產卡泊芬凈和進口卡泊芬凈分別對4株曲霉菌的MEC結果較24 h高出2個濃度梯度，分別對10株和14株曲霉菌高出1個濃度梯度。米卡芬凈對曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結果間具有最高的一致性，僅有7株曲霉菌相差1個濃度梯度。

表3棘白菌素類藥物對75株曲霉菌24 h和48 h藥敏測定結果的一致性分析 (n)

Tab.3Comparison of 24h and 48h MEC values of echinocandins against 75Aspergillusisolates

藥物棘白菌素類藥物對曲霉菌24 h和48 h MEC結果相差梯度株數比較0+1濃度梯度+2濃度梯度卡泊芬凈(國產)61104卡泊芬凈(進口)57144米卡芬凈6870

3 討 論

曲霉菌是環境中廣泛存在的條件性致病真菌，可引起人類的過敏性、慢性或者侵襲性曲霉病。侵襲性曲霉病是曲霉菌感染最嚴重的一種類型，主要累及免疫功能缺陷的患者，在免疫缺陷患者中具有很高的發病率和死亡率[10]。從全球范圍來看，煙曲霉是造成侵襲性曲霉病最常見的致病菌，超過90%的侵襲性曲霉病是由煙曲霉引起的，其次是黃曲霉、黑曲霉和土曲霉。唑類藥物是曲霉病治療最主要的一線藥物，然而，曲霉的唑類藥物耐藥現象已經成為刻不容緩的全球問題[11]?？ú捶覂艟哂胁煌谶蝾愃幬锏莫毺刈饔脵C制，大量體外試驗的證據表明卡泊芬凈產生耐藥性的可能性極低[12]。

本研究結果表明，棘白菌素類藥物對曲霉菌臨床分離株展現了很高的體外抗真菌活性，米卡芬凈的體外抗真菌活性又高于卡泊芬凈，這一結果與Pfaller等[13]研究者的報道一致。根據CLSI規定的流行病學折點(epidemiological cutoff values, ECVs)進行判讀，本研究全部菌株對伏立康唑和泊沙康唑均敏感，但是分別有16株煙曲霉、2株黃曲霉和5株黑曲霉對伊曲康唑耐藥。這一現象的原因可能可以用Prigitano等的研究進行解釋：近年來，大量農業唑類抗真菌劑的廣泛使用導致了環境耐藥菌株的產生，其主要的耐藥機制為Cyp51A基因上游啟動子出現TR34/L98H突變，而這一突變主要與伊曲康唑的耐藥高度相關，與伏立康唑和泊沙康唑的抗菌敏感性沒有明確關系[11]。這一結果也提示我們加強對臨床和環境曲霉菌的抗真菌耐藥監測，尋找替代殺菌劑，對減少因使用農業唑類抗真菌劑而產生的耐藥至關重要。

已有報道表明兩性霉素B對土曲霉具有較高的MIC值[14]，本研究中兩性霉素B對5株土曲霉的MIC50和MIC90的分別為0.5 μg/mL和1 μg/mL，未觀察到較高的MIC值，可能是由于菌株數量有限。值得注意的是，本研究中兩性霉素B對15株黃曲霉菌株的MIC50和MIC90分別為2 μg/mL和4 μg/mL，明顯高于其他菌種，因此，臨床工作中對曲霉菌進行藥敏試驗對于合理治療至關重要。

不同于曲霉菌加入唑類藥物和兩性霉素B后， 35℃孵育48 h再讀取其MIC值，CLSI推薦曲霉菌加入棘白菌素類藥物后，35℃孵育24 h即可讀取其MEC值，即與單純曲霉生長對照孔的菌絲相比，顯微鏡下開始觀察到菌絲變短、變粗和高度分叉改變的最低藥物濃度[5]。本研究對卡泊芬凈和米卡芬凈24 h和48 h藥敏測定結果的一致性進行了比較，發現卡泊芬凈對超過76%的曲霉菌24 h和48 h的藥敏測定結果完全一致，而米卡芬凈的一致性更高(90.7%)。

此外，本研究顯示受試菌體外對國產卡泊芬凈與進口卡泊芬凈的敏感性高度一致，國產卡泊芬凈與進口卡泊芬凈對37株曲霉菌的MEC值中，僅11株菌的MEC值存在不一致，且僅相差一個濃度梯度，無極大錯誤、大錯誤和小錯誤的發生。因此，兩種卡泊芬凈對曲霉體外藥敏測定結果高度一致。而且國產卡泊芬凈對煙曲霉、土曲霉和其他少見曲霉的體外抗真菌活性可能優于進口卡泊芬凈。

綜上所述，相較于唑類藥物和兩性霉素B，卡泊芬凈對曲霉具有較好的體外抗真菌活性，且國產卡泊芬凈與進口卡泊芬凈的體外抗菌活性高度一致。