山丹種子表面滅菌方法篩選試驗初報

陳靜 李發虎 李龍梅 侯佳

摘 ? 要 ?山丹別名細葉百合，為百合科百合屬卷瓣組的多年生草本植物。山丹抗性強、花期長，極具觀賞價值，是北方地區難得的城市綠化、美化材料。為提高組織培養效率，加快山丹的工廠化育苗進程，以3年生細葉百合種子為試材，觀察無菌播種中不同表面滅菌方法對污染率、種子生長情況的影響，結果表明在光照強度2 000 lx、溫度（25±2） ℃的培養條件下，用75%乙醇消毒30 s配合0.1%NaClO處理15 min，可以取得較高的發芽率，保證較高的幼苗質量。

關鍵詞 ? 山丹;組織培養;品種改良;污染率;發芽率

中圖分類號：S682.2+9 ? ?文獻標志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.16.017

山丹（Lilium pumilum DC.）別名細葉百合，為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）卷瓣組的多年生草本植物。我國野生山丹種質資源豐富，在河北、河南、陜西、山西、山東、內蒙古、甘肅、寧夏、遼寧、吉林、黑龍江、青海、北京等多?。ㄊ校V泛分布[1]。山丹適應性強，具有較強的抗寒、抗旱性和抗病害能力，且花期長，是北方地區難得的城市綠化、美化材料。山丹具抗寒、抗病等優良性狀，是百合抗性育種和品質改良的重要基因資源[2-4]。山丹中含有甾體皂苷、生物堿、磷脂、硝酸甘油酯、多糖等多種活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性[5]。近年來人們逐漸認識到山丹廣闊的應用前景，在組織培養和品種改良方面做了大量工作，推進其產業化進程。

百合屬植物具有較高的再生能力，已經報道的組織培養方法達40多種[6]。組織培養可以有效提高山丹繁殖效率，改善品質退化等，目前已經建立了山丹離體快繁的再生體系，并對山丹組培苗的繼代培養、生根培養及移栽條件進行了研究[7-10]。在實踐操作中，山丹組織培養存在生長緩慢、愈傷組織誘導率低、分化緩慢等問題，不利于工廠化生產推廣。前人的研究表明，山丹種子在20～25 ℃時，有較高的萌發率，近90%，栽培后，種子萌發率下降至不足60%。弱光（10～20 μmol·m-2·s-1）能有效縮短山丹種子萌發完全所需的時間，并提高種子萌發率[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為蒙草公司種質資源研發中心種質圃內栽培的3年生細葉百合種子。采種時間為2016年9月，將采收的細葉百合種子置于4 ℃低溫黑暗處保存。本試驗選擇飽滿、胚清晰（胚長≥1/2種長）的種子為材料，于2017年3—5月在內蒙古農業大學職業技術學院科技園區組織培養中心進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理

試驗參考馬儀迪等[12]的巨球百合種子無菌播種方法進行。將種子置于添加洗潔精1～2滴的水溶液中浸泡30 min，去除干癟的種子;流水沖洗2～4 h，用軟毛刷輕輕刷洗種子表面，并用無菌濾紙吸干種子表面水分。

1.2.2 滅菌處理

在超凈工作臺內，首先用70%乙醇消毒30 s，再用無菌水振蕩沖洗3次;以1%NaClO和0.1%的升汞做振蕩處理（滅菌時間分別為0， 5， 10， 15， 20， 25， 30 min），再用無菌水蕩洗3次，用滅菌濾紙吸干水分后，將種子接種到MS培養基上。試驗采用單因素完全隨機設計，每個處理重復3次，每個重復接種3瓶，每瓶接種5枚種子。

1.2.3 培養條件

培養基為MS培養基，添加6-BA 0.5 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1這兩種植物激素。無菌培養室光照度約2 000 lx，每天光照13 h，培養溫度為（25±2）℃。每天觀察種子發芽情況，以胚根露出種皮1～2 mm作為發芽標志。

1.2.4 數據記錄與統計分析

培養14 d后觀察組培苗的滅菌效果，統計各處理無菌苗的污染率。培養21 d后統計發芽率，并用螺旋測微尺測量胚芽長度。

污染率（%）=發生污染的種子數/接種的種子數×100;

發芽率（%）=發芽的種子數/接種的種子數×100。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌處理對污染率的影響

隨著0.1%NaClO處理時間增加，污染率明顯降低（見表1），其中振蕩0 min、5 min處理的種子污染嚴重，污染率都為100%;振蕩處理10 min的污染率明顯降低，為64.44%;處理15 min后，污染率降到6.77%;隨著處理時間的繼續增加，污染率穩定在10%以下，分別為2.22%、6.67%、4.44%。

2.2 不同滅菌處理對種子發芽情況的影響

經0.1%NaClO處理時間在15 min以內的細葉百合種子，開始萌發時間變化不大，都為7～8 d，而處理20 min、25 min、30 min的種子開始萌發時間較晚，為12 d、13 d、15 d（見表2）。隨著0.1%NaClO處理時間增加，細葉百合種子的完全萌發時間逐漸延長（除0 min、5 min處理因污染未記錄數據），其中10 min和15 min兩個處理的完全萌發時間最短，為14 d和16 d，30 min處理的完全萌發時間為22 d。發芽率記錄結果顯示，0 min、5 min處理因污染嚴重未記錄到數據;10 min處理的發芽率明顯增加，為60%;處理15 min的發芽率最高，為91.11%;之后隨著處理時間增加，發芽率呈逐漸下降的趨勢。

經0.1%NaClO處理不同時間的細葉百合種子，胚芽伸長情況為（0 min、5 min、30 min因污染、死亡或胚芽過短未得到數據）隨著處理時間增加，胚芽長度先升增大后減?。ㄒ姳?），其中處理15 min的胚芽最長，為1.545 0 cm。

3 小結

隨著山丹獨特的觀賞價值、良好的生態適應性、藥用和營養價值逐漸被市場認可，其生產規模將逐漸擴大，工廠化育苗生產將提上日程。與其他百合科植物相比，山丹組織培養增值率低、分化緩慢，在工廠化生產中存在瓶頸。百合種子發芽率高、生長迅速，但發芽持續時間長，可達40 d以上[11]，生長情況也參差不齊，不符合規?；a要求。無菌播種開始萌發時間短、發芽持續時間短，生長情況較為接近，可以作為山丹工廠化生產的有效切入點。

污染是無菌播種過程中的重要問題，決定無菌播種成敗的關鍵。山丹種子常攜帶大量微生物且難以清除，故明確無菌播種中種子的生理狀態，篩選最佳滅菌劑種類、滅菌時間及滅菌方法等都是需要解決的問題[13-14]。

試驗結果表明，0.1%NaClO處理時間在5 min以內的，滅菌效果不理想;處理時間在15 min及以上的，滅菌效果較好，且隨著滅菌時間延長，污染率逐漸降低，胚芽生長健壯。0.1%NaClO處理時間在15 min及以下的，開始萌發時間和完全萌發時間變化不大，處理20 min以上的開始萌發時間和完全萌發時間表現為隨著處理時間延長而明顯增加。隨著0.1%NaClO處理時間的增加，山丹種子的胚芽長度先增大后減小，在15 min處理達到最大，之后呈明顯下降趨勢，這說明較長時間的0.1%NaClO處理對山丹種子的萌發會產生不良影響。

綜上所述，山丹無菌播種在光照強度2 000 lx、溫度（25±2） ℃的培養條件下，用75%乙醇消毒30 s配合0.1%NaClO處理15 min，可以取得較高的發芽率，保證較高的幼苗質量。

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（責任編輯：易 ?婧）