甜瓜種子傳帶真菌初步研究

(中國農業大學植物保護學院， 北京 100193)

甜瓜(CucumismeloL.)屬于葫蘆科、甜瓜屬，別名香瓜、甘瓜、哈密瓜，為一年生匍匐性或攀緣性草本植物[1]。甜瓜果實香甜可口，果肉含有豐富的水分、維生素和碳水化合物，可消暑清熱、生津止渴；含有蛋白質、脂肪和無機鹽等，能補充人體所需的能量和多種營養素；含有將不溶性蛋白質轉化為可溶性蛋白質的轉化酶，可有助于營養吸收；瓜蒂中的葫蘆素B具有保護肝臟，減輕肝損傷，繼而阻止肝細胞脂肪變性以及抑制纖維增生的功能；瓜籽中的蛋白質、纖維和粗油含量分別為25.2%、15.4%和37.8%[2]；瓜籽中有較高的賴氨酸，含硫氨基酸次之，還有大量的礦物質，特別是鎂、鉀和磷[3]。目前甜瓜在熱帶和溫帶地區廣泛種植，其主要種植國為中國、美國、西班牙、土耳其和伊朗等。我國主要分布在新疆、甘肅、內蒙古等西北地區，20世紀80年代開始在華北、華中、華南及臺灣地區種植[4]。據聯合國糧農組織(FAO)統計，中國甜瓜的種植面積約為42.78萬hm2，總產量達1 440萬t(http://faostat3.fao.org/download/Q/QC/E)。近年來，保護地甜瓜連年種植，使其生長環境中病原菌大量積累，加上保護地內高溫、高濕的生長環境，導致甜瓜病害發生日趨嚴重，制約了甜瓜產業的健康發展[4-5]。國外的一項研究表明，甜瓜等葫蘆科作物種子共攜帶有8種真菌，分別是青霉菌、鏈格孢菌、鐮刀菌、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、炭疽菌(Colletotrichumspp.)、殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)和黑曲霉(Aspergillusniger)[6]。而陳祥付等[7]報道，從5個甜瓜品種的種子上檢測到鐮刀菌、根霉和鏈格孢菌。本研究對來自10個省市的32個甜瓜品種的種子傳帶真菌情況進行檢測，旨在初步明確其傳帶的主要真菌種類，從而為生產中甜瓜品種的選擇及進行合適的種子處理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試甜瓜品種

供試甜瓜品種共32個，其中金玉滿堂、京蜜11號、蜜脆香園、京蜜10號、京蜜15號、京蜜8號、伊麗莎白、久久紅、京蜜9號、YLJ一特金、京蜜7號、金碧輝煌、一特白、一特金2號、久青蜜、京玉2號等來自北京市；綠源來自河北??；青甜17號、綠香甜、和甜九號、春甜十三、綠麻瓜、黃金道、刀摟子、香香甜瓜等來自黑龍江??；綠寶石669來自遼寧??；吉祥紅玉來自吉林??；綠蘿來自陜西??；玉金香來自甘肅??；盛開花來自河南??；久紅瑞來自安徽??；東方蜜一號來自上海市。

1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基[8]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。培養基在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用。

1.3 供試試劑

無菌水，1%次氯酸鈉溶液。

1.4 種子攜帶真菌檢測

參考Mathur等[9]的方法并稍加改進。具體操作步驟如下：

1) 每個甜瓜品種隨機選取400粒種子。

2) 從400粒種子中隨機選取40粒種子，將選取的種子均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個處理4次重復；然后置于25～28 ℃的培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄干種子帶菌種類并計算分離頻率。

3) 將剩余的360粒甜瓜種子分別置于100 mL燒杯中，用30 mL無菌水充分洗滌后，吸取1 mL洗滌懸浮液放入1.5 mL離心管中，4 000 r·min-1離心15 min后棄上清液，再向離心管中加入500μL無菌水，充分振蕩懸浮后吸取100μL均勻涂布于直徑為9 cm的PDA平板上，每個處理4次重復。在相同的操作條件下空白對照為無菌水。然后置于25～28 ℃培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄某類真菌菌落個數和菌落總數并計算分離比例。

4) 從 3) 無菌水洗滌后的甜瓜種子中每個品種隨機選取40粒，晾干后將種子均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每個處理4次重復。然后置于25～28 ℃的培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄水洗后種子帶菌種類并計算分離頻率。

5) 從 3) 無菌水洗滌后的甜瓜種子中每個品種隨機選取100粒，在1% NaClO溶液中浸泡5 min后再用無菌水充分洗滌3遍，晾干后將種子均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，10粒/皿，每個處理4次重復。然后置于25～28 ℃培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄1% NaClO處理后種子帶菌種類并計算分離頻率。

6) 將剩余的甜瓜種子隨機選取40粒，使用鈍頭鑷子等對種子進行種皮和種仁的分離。將處理后的完整種皮均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個處理4次重復。然后置于25～28 ℃的培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄種皮帶菌種類并計算分離頻率。

7) 將6) 中剝離的完整種仁均勻放置在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿10粒，每個處理4次重復。然后置于25～28 ℃的培養箱中12 h黑暗/12 h光照條件下培養5 d后進行檢查，記錄種仁帶菌種類并計算分離頻率。

1.5 種子攜帶真菌初步鑒定

將分離得到的真菌分別進行純化、保存。根據真菌培養性狀和形態特征，參考工具書進行初步鑒定[10-13]。

2 結果與分析

2.1 甜瓜干種子帶菌檢測結果

32個甜瓜品種的干種子帶菌情況差異較大(詳見表1)。綠源、京蜜11號、青甜17號、京蜜10號、綠香甜、和甜九號、春甜十三、盛開花、金碧輝煌、久久紅和久紅瑞等11個品種的干種子均未檢測到真菌；金玉滿堂和綠麻瓜等2個品種干種子帶菌率高達100%；吉祥紅玉、綠麻瓜、刀摟子和玉金香等4個品種干種子只檢測到青霉菌；金玉滿堂和黃金道等2個品種干種子檢測到青霉菌和曲霉菌；久青蜜、京蜜8號和京蜜7號等3個品種干種子檢測到鐮刀菌；蜜脆香園、京蜜15號、YLJ一特金和京蜜9號等4個品種干種子檢測到鏈格孢菌；綠寶石669、香香甜瓜、一特白、京玉2號和一特金2號等5個品種干種子檢測到鐮刀菌和鏈格孢菌。

表1 甜瓜干種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它金玉滿堂100.010.090.0———綠寶石66940.025.0—12.56.356.3綠蘿17.542.9———71.4蜜脆香園10.0———100.0—京蜜15號10.0———50.050.0吉祥紅玉47.5100.0————久青蜜25.040.0—40.0—40.0綠麻瓜100.0100.0————黃金道70.092.925.0———刀摟子12.5100.0————香香甜瓜17.571.4—28.642.6100.0京蜜8號10.0——100.0——YLJ一特金90.05.6——11.183.3京蜜7號10.0——100.0——東方蜜一號50.0————100.0伊麗莎白60.025.016.7——58.3京蜜9號20.0———37.587.5一特白57.513.073.956.517.4—京玉2號62.556.012.044.044.024.0一特金2號80.025.0—12.562.5—玉金香40.0100.0————

注：“—”表示未檢測到該種真菌。下同。

表2 水洗后甜瓜種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它金玉滿堂100.090.0———10.0綠蘿10.066.7—100.0100.0—京蜜15號75.0————100.0綠香甜16.7——40.0—60.0吉祥紅玉20.083.3———50.0久青蜜15.0100.0————綠麻瓜50.0100.0100.0———黃金道33.360.050.0———刀摟子20.0100.0————YLJ一特金26.787.5——62.5—京蜜7號25.020.060.020.020.0—東方蜜一號30.025.0—25.050.0100.0伊麗莎白17.571.4100.028.642.971.4京蜜9號7.5——66.733.3—一特白35.050.0———75.0京玉2號12.5100.0———100.0一特金2號20.0——62.550.0100.0玉金香95.0——40.010.581.6

2.2 甜瓜種子洗滌懸浮液帶菌檢測結果

綠香甜、和甜九號、春甜十三、盛開花、YLJ一特金和伊麗莎白等6個品種的種子洗滌懸浮液中均檢測到真菌。綠香甜、和甜九號、春甜十三和盛開花等4個品種種子洗滌懸浮液為青霉菌、曲霉菌以及鏈格孢菌，其中春甜十三的鏈格孢菌分離比例高達66.7%，和甜九號和盛開花的曲霉菌分離比例分別為13.3%和25.0%，和甜九號的青霉菌分離比例為86.7%；伊麗莎白種子洗滌懸浮液檢測到青霉菌、曲霉菌和鐮刀菌，其中鐮刀菌的分離比例為25.0%；YLJ一特金種子洗滌懸浮液檢測到青霉菌。其余甜瓜品種種子洗滌懸浮液均未檢測到真菌。

2.3 水洗后甜瓜種子帶菌檢測結果

32個甜瓜品種的種子經過水洗后帶菌檢測結果為：綠源、京蜜11號、綠寶石669、青甜17號、蜜脆香園、京蜜10號、和甜九號、春甜十三、香香甜瓜、盛開花、京蜜8號、金碧輝煌、久久紅和久紅瑞等14個甜瓜品種的種子水洗后均未檢測到真菌；金玉滿堂種子帶菌率高達100%；久青蜜和刀摟子種子水洗后只檢測到青霉菌；綠麻瓜和黃金道種子水洗后檢測到青霉菌和曲霉菌；綠香甜種子水洗后檢測到鐮刀菌；YLJ一特金種子水洗后檢測到鏈格孢菌；綠蘿、京蜜7號、東方蜜一號、伊麗莎白、京蜜9號、一特金2號和玉金香等7個品種的種子水洗后檢測到鐮刀菌和鏈格孢菌(表2)。

2.4 種子帶菌檢測結果

32個甜瓜品種的種子經過1%NaClO處理后的帶菌檢測結果為：綠源、金玉滿堂、青甜17號、綠蘿、蜜脆香園、京蜜10號、京蜜15號、和甜九號、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、綠麻瓜、刀摟子、香香甜瓜、盛開花、京蜜7號、東方蜜一號、伊麗莎白、金碧輝煌、京蜜9號、一特白、京玉2號、一特金2號、玉金香和久紅瑞等25個甜瓜品種的種子均未檢測到真菌；黃金道種子只檢測到青霉菌；京蜜11號、綠寶石669、綠香甜、京蜜8號、久久紅和YLJ一特金等6個品種的種子檢測到鐮刀菌或鏈格孢菌(表3)。

表4 1%NaClO處理后甜瓜種皮傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它綠源10.0100.0———金玉滿堂22.544.4——77.8京蜜11號32.553.869.2——綠寶石66920.0—75.037.5—綠蘿10.0100.0———京蜜10號10.0———100.0綠香甜10.0100.0——100.0綠麻瓜62.5100.0———盛開花10.0———100.0東方蜜一號10.0—100.0——伊麗莎白45.0———100.0京蜜9號20.050.0——50.0久紅瑞62.5———100.0

表5 甜瓜種仁傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌曲霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它綠源10.0100.0————金玉滿堂15.0—83.3——66.7京蜜11號25.020.0—50.0—30.0綠寶石66910.025.0—100.0——綠蘿12.560.0———80.0蜜脆香園10.0————100.0綠香甜40.037.5———100.0和甜九號20.0100.0————綠麻瓜90.0100.0————黃金道10.0100.025.0———刀摟子12.5——100.0—100.0京蜜7號30.0———50.050.0伊麗莎白100.0————100.0久紅瑞90.0————100.0

表3 1% NaClO處理后甜瓜種子傳帶的真菌種類和分離頻率

甜瓜品種 帶菌率/%真菌種類和分離頻率/%青霉菌鐮刀菌鏈格孢菌其它京蜜11號30.0—75.0—50.0綠寶石66920.0——12.587.5綠香甜10.0—100.0——黃金道10.0100.0———京蜜8號10.0——100.0—YLJ一特金20.050.0—50.0—久久紅10.0——100.0—

2.5 種皮帶菌檢測結果

32個甜瓜品種的種子經過1% NaClO處理后種皮帶菌檢測結果為：青甜17號、蜜脆香園、京蜜15號、和甜九號、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、黃金道、刀摟子、香香甜瓜、京蜜8號、YLJ一特金、京蜜7號、金碧輝煌、一特白、久久紅、京玉2號、一特金2號和玉金香等19個甜瓜品種的種皮均未檢測到真菌；綠源、金玉滿堂、京蜜11號、綠蘿、綠香甜、綠麻瓜和京蜜9號等7個品種的種皮檢測到青霉菌；京蜜11號、綠寶石669和東方蜜一號等3個品種的種皮檢測到鐮刀菌，綠寶石669還檢測到鏈格孢菌(表4)。

2.6 種仁帶菌檢測結果

32個甜瓜品種的種子種仁帶菌檢測結果為：青甜17號、京蜜10號、京蜜15號、春甜十三、吉祥紅玉、久青蜜、香香甜瓜、盛開花、京蜜8號、YLJ一特金、東方蜜一號、金碧輝煌、京蜜9號、一特白、久久紅、京玉2號、一特金2號和玉金香等18個甜瓜品種的種仁未檢測到真菌；綠源、京蜜11號、綠寶石669、綠蘿、綠香甜、和甜九號、綠麻瓜和黃金道等8個品種種仁檢測到青霉菌；金玉滿堂和黃金道等2個品種種仁檢測到曲霉菌；京蜜11號、綠寶石669、刀摟子等3個品種種仁檢測到鐮刀菌；京蜜7號檢測到鏈格孢菌(表5)。

3 結論與討論

來自北京、河北、黑龍江、遼寧、吉林、陜西、甘肅、河南、安徽和上海等地的32個甜瓜品種的種子帶菌情況檢測結果為：干種子、種子洗滌懸浮液、水洗后種子、1% NaClO處理后種仁等均可檢測到青霉菌、曲霉菌、鐮刀菌和鏈格孢菌，但是不同品種之間的帶菌情況差異較大。21個甜瓜品種的干種子上檢測到真菌，其中金玉滿堂和綠麻瓜的帶菌率高達100%，綠寶石669、香香甜瓜、一特白、京玉2號和一特金2號的干種子檢測到鐮刀菌和鏈格孢菌；只有6個甜瓜品種的種子洗滌懸浮液中檢測到真菌；水洗后，14個甜瓜品種的種子上未檢測到真菌，但金玉滿堂種子帶菌率仍高達100%；經1% NaClO處理后只有7個甜瓜品種的種子上檢測到真菌；經1% NaClO處理后，19個甜瓜品種的種皮上未檢測到真菌，且所有甜瓜品種的種皮均未檢測到曲霉菌；18個甜瓜品種的種仁未檢測到真菌，京蜜11號、綠寶石669、刀摟子和京蜜7號的種仁中檢測到鐮刀菌或鏈格孢菌。本研究也從多個甜瓜品種上分離得到鐮刀菌和鏈格孢菌，這與陳祥付等[7]的研究結果相似。

已有報道表明，尖孢鐮刀菌甜瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.melonis)引起甜瓜枯萎病[14]；再育鐮刀菌(F.proliferatum)和木賊鐮刀菌(F.equiseti)可引起甜瓜根莖腐[15]；腐皮鐮刀菌(F.solani)可引起甜瓜根腐病[16]。鐮刀菌可以在土壤中存活多年[17]，種子也可以傳帶鐮刀菌[7]。此外，交鏈格孢(Alternariaalternata)引起甜瓜黑斑病[18]，瓜鏈格孢(A.cucumerina)引起甜瓜葉枯病[19]，西葫蘆生鏈格孢(A.peponicola)引起甜瓜大斑病[20]。其中甜瓜黑斑病菌(A.alternata)和甜瓜葉枯病菌(A.cucumerina)以菌絲體或者分生孢子的形式在病殘體上越冬，或者分生孢子附著在種子表面越冬[21-22]；甜瓜大斑病菌(A.peponicola)以菌絲體和分生孢子分別在病葉組織內外越冬，成為翌年初侵染源，種子是否帶菌尚待研究[23]。本研究從甜瓜種子上分離得到的鐮刀菌和鏈格孢菌種類還有待鑒定，且其對甜瓜是否有致病性、對甜瓜種子萌發是否有影響還需要進一步研究。