血必凈注射液對膿毒癥患者血漿組蛋白H4的影響及意義*

王力軍 ，王鏡媛 ，郭 菲 ，王紫怡 ，宋瑞雯

（1.天津醫科大學總醫院急診醫學科，天津 300052；2.天津醫科大學總醫院空港醫院急診醫學科，天津 300308；3.天津中醫藥大學管理學院，天津 301617）

機體對感染的反應失調而導致危及生命的器官功能障礙即膿毒癥，進一步可發展為膿毒性休克，膿毒癥病死率約30%～50%[1-2]。目前膿毒癥發病機制尚未完全明確[1]。分子標志物是膿毒癥研究熱點，但尚缺乏評估嚴重程度和預后的良好指標[3]。近期研究顯示，胞外組蛋白（EH）劑量依賴性刺激炎癥介質釋放、活化凝血、誘導中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）形成，導致膿毒癥小鼠內皮細胞損傷、器官功能衰竭甚至死亡[4-6]。EH由 H1、H2A、H2B、H3、H4 5種蛋白構成[7]。輸注EH4抗體能阻斷蛋白C活化，降低小鼠病死率[4，8]。

血必凈注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等藥物組成，具有抑制炎癥介質釋放、改善微循環、調節免疫功能、保護血管內皮細胞等功效[9]。本研究主要觀察血必凈注射液是否通過降低膿毒癥患者EH4，從而糾正凝血功能紊亂，調節炎癥反應，改善病情嚴重程度，降低病死率。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象 對2017年7月—2018年6月天津醫科大學總醫院急診醫學科收治的膿毒癥患者，采用隨機數字表，末尾為奇數者入對照組（30例），偶數者入治療組（30例）。其中對照組男18例，女12例，平均年齡（64.60±15.82）歲；治療組男 16例，女14例，平均年齡（65.08±14.68）歲。兩組間在年齡及性別上無統計學差異，具有可比性。所有患者（或家屬）均告知此研究的目的、研究程序以及參加此研究的利弊，簽署知情同意書。本研究經天津醫科大學總醫院倫理委員會審核通過（IRB2018-152-01）。

1.2 病例納入標準 序貫器官衰竭評估評分（SOFA），見表1。各系統分數之和即為該患者SOFA分值。在感染的基礎上，△SOFA分值≥2分；或快速SOFA分值≥2分時即為膿毒癥[1]。符合此標準者即為納入標準。

1.3 病例排除標準 1）年齡＞80歲或＜18歲。2）腫瘤。3）失代償性肝硬化。4）急性壞死性胰腺炎。5）慢性終末期腎病。6）孕婦。7）免疫性疾病活動期。8）凝血功能障礙（血小板＜50×109/L、凝血酶原時間＞16 s或纖維蛋白原＜1.0 g/L）。9）不能完成該試驗者。

1.4 治療方法 兩組患者均按照膿毒癥相關指南進行治療。治療組在此基礎上，每日靜脈靜滴0.9%NaCl 100 mL+血必凈注射液100 mL，每日2次。連續治療7 d。

表1 SOFA評分Tab.1 Sequential Organ Failure Assessment score

1.5 觀察指標 EH4：患者入院時、24 h及72 h時，抗凝管采血5 mL，4℃保存20 min后3 000 r/min離心10 min。收集血漿，-80℃保存。采用上海廣銳生物科技有限公司提供的EH4（批號20171226）檢測試劑，用酶聯免疫分析法檢測EH4水平。

血漿D-二聚體、白介素-6（IL-6）和其他指標由本院檢驗中心測定。計算患者入院時和72 h疾病嚴重程度急性生理與慢性健康評分（APACHE評分Ⅱ）、SOFA評分，并隨訪28 d生存狀態。

1.6 統計學方法 SPSS 24.0軟件統計分析。定量資料以均數±標準差（x±s）表示，符合正態分布的兩組間比較采用兩獨立樣本檢驗；非正態分布的計量資料比較采用Mann-Whitney U檢驗。定性資料組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman對EH4與白細胞、血小板、IL-6和D-二聚體進行相關性分析。繪制ROC曲線判斷入院時EH4水平與膿毒癥預后關系，找出最佳截斷點，計算曲線下面積、靈敏度及特異度。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后各參數的比較 治療前兩組間EH4水平、血漿D-二聚體及IL-6水平無統計學差異（P＞0.05），治療24 h時具有統計學差異（P值分別為＜0.001、0.04和0.03）。72 h時 EH4水平具有統計學差異（P＜0.05），血漿D-二聚體及IL-6水平均無統計學差異（P＞0.05），見表 2。

表2 兩組患者治療前后各參數的比較（x±s）Tab.2Comparison of parameters between two groups before and after treatment（x±s）

2.2 兩組患者入院時及72 h時疾病嚴重程度的比較 兩組患者入院時APACHE II和SOFA分值無統計學差異。72 h時兩組間APACHE II評分和SOFA分值具有統計學差異（P＜0.01），見表2。

2.3 EH4水平與各參數的相關性分析 兩組患者入院時、24 h及72 h時EH4與白細胞、血小板、IL-6和D-二聚體各參數的相關性分析，見表3。

2.4 入院時EH4水平與72 h時疾病嚴重程度的相關性分析 入院時EH4與膿毒癥患者72 h時APACHEⅡ分值和SOFA分值的相關系數分別為0.71和0.68，見圖1和圖2。

表3 EH4與各參數的相關性分析Tab.3 Correlation analysis between EH4 and various parameters

圖1 EH4與72 h時APACHEⅡ分值相關性分析Fig.1 Correlation analysis between EH4 and APACHE II scores at 72 h

圖2 EH4與72 h時SOFA分值相關性分析Fig.2 Correlation analysis between EH4 and SOFA scores at 72 h

2.5 入院時EH4水平與膿毒癥患者預后關系 60例患者28 d時存活36例，死亡24例。存活和死亡患者入院時EH4水平分別為（466.83±25.95）和（531.92±41.94）pg/mL，具有統計學差異（P＜0.001）。以此值判斷膿毒癥患者預后，繪制ROC曲線。曲線下面積為0.930，最佳截斷點為501.92 pg/mL，此時EH4判斷膿毒癥患者預后的靈敏度為79.2%，特異度為94.4%，見圖 3。

3 討論

圖3 入院時EH4水平判斷預后的ROC曲線Fig.3 ROC curve of EH4 level at admission on predicting prognosis

膿毒癥發病機制尚未完全明確。過度的炎癥反應和凝血功能障礙是其主要發病機制，多采用抗生素、營養支持、血液凈化等方式治療。而中醫學認為其與正虛毒損、絡脈瘀滯有關[10]。血必凈注射液是根據“四證四法”的辨證治療原則研制的復方制劑，即活血化瘀法治療瘀血，清熱解毒法治療毒熱，扶正固本法治療正氣不足，通里攻下法治療痰濕內阻[11]。研究表明血必凈注射液可抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、IL-6 和白介素-8（IL-8）等炎癥介質的過度分泌[12]。進一步發現其可糾正膿毒癥及嚴重膿毒癥凝血紊亂，恢復器官功能，改善血流動力學狀態及嚴重程度，降低病死率[12-15]。本研究發現，血必凈注射液能夠降低膿毒癥患者24 h時EH4水平、血漿IL-6及D-二聚體水平；降低72 h時APACHE II和SOFA評分分值，與Wang F等研究結果一致[12，16]。

3.1 EH4與膿毒癥凝血功能障礙 膿毒癥患者常伴凝血功能障礙，影響其預后[17]。EH以時間依賴性的方式誘導凝血酶-抗凝血酶復合物（凝血激活的標志物）的生成，加重凝血功能紊亂。注射EH抗體后該復合物顯著下降[18]。Dhainaut JF等[19]發現近乎100%的膿毒癥患者出現血漿D-二聚體升高，其次為蛋白C降低、凝血酶原時間及部分凝血活酶時間的延長和血小板數量下降。血漿D-二聚體在反映凝血功能障礙方面尤為重要[20-21]。Peng W等[22]發現血必凈注射液及EH4均可影響血漿D-二聚體，與本研究結果一致。此外，Yipp BG等[23-24]發現EH導致大量血小板聚集、凝血酶激活和纖維蛋白斑塊形成。EH尚可激活Toll樣受體（TLR），產生凝血酶，激活和聚集血小板，導致血小板數量下降。本研究發現EH4與血小板之間無明顯相關性，可能與樣本量小有關，見表3。

3.2 EH4與膿毒癥炎癥反應 作為損傷相關分子模式的新成員，EH以配體受體的形式與TLR2及TLR4相互作用，通過激活其下游髓樣分化因子88（MyD88）蛋白及NF-κB信號通路，啟動和調控炎癥因子的表達及釋放[25]。EH以時間和劑量依賴性的方式誘導白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、白介素-10（IL-10）、白介素-18（IL-18）和及 TNF-α 的釋放[16，18，24，26]。這些標志物在抗組蛋白治療后下降[16，27-28]。本研究發現治療組患者24 h時血漿IL-6水平明顯低于對照組，其與EH4有較好的相關性（r=0.69）。Wang Q等[29]發現血必凈注射液下調高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達，降低IL-6及TNFα等炎癥因子釋放。EH4及HMGB1均為內源性損傷相關模式分子成員。推測血必凈注射液可能通過降低EH4進而降低IL-6水平。

此外，本研究中兩組患者72 h時EH4水平具有統計學差異，但與課題組既往研究的健康志愿者水平近似（數據尚未發表），考慮可能與EH4本身代謝有關。研究表明，盲腸穿孔結扎小鼠后6～30 h可檢測到組蛋白，峰值出現在8 h[30-31]。Alhamdi Y等[32]表明EH在膿毒癥后10 h開始出現，達峰時間為16～24 h，24 h 后逐漸下降。

4 局限性

首先，血必凈注射液治療后EH4、IL-6與血漿D-二聚體水平均下降，且EH4與IL-6、血漿D-二聚體水平具有較好的相關性，此并不能證明他們之間的因果關系。其次，炎癥反應和凝血功能影響因素復雜，本研究中僅將IL-6和血漿D-二聚體作為炎癥反應和凝血功能的指標，略顯不足。

總之，膿毒癥患者EH4水平與疾病嚴重程度呈正相關，死亡患者EH4水平顯著高于存活者。血必凈注射液可能通過降低EH4水平，發揮改善炎癥反應、凝血功能紊亂和疾病嚴重程度的作用。EH4既是反映膿毒癥嚴重程度及預后的生物標記物，也是潛在治療靶點之一。