奶粉中維生素B2標準物質的研制

引言

維生素B2，是人體必需的營養元素[1]，是嬰幼兒等配方奶粉的重要添加物。為了保障科學定量攝入，準確定量檢測奶粉中維生素B2對監管奶粉營養成分及安全具有重要意義[2]。研制奶粉中維生素B2標準物質，不僅可保證檢測結果的準確性，還能為食品、營養學的分析檢測和研究提供量值溯源保障[3]。本文按照ISO導則35[4]，對標準物質進行均勻性檢驗、穩定性考察、定值分析和不確定度評價。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀，美國Agilent；高壓滅菌鍋；恒溫水浴鍋；HCl、NaOH、三水乙酸鈉、冰乙酸，優級純；甲醇，色譜純；木瓜蛋白酶；高峰淀粉酶；維生素B2（C17H20N4O6） 標 準 品，CAS號：83-88-5， 純 度≥98%。

1.2 定值方法

取2.0 g樣品于具塞比色管中，加入60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，搖勻，放入高壓滅菌鍋，121℃下保持30min，冷卻。用1 mol/LNaOH調pH至6.0～6.5，加2 mL混合酶（稱2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解定容至50 mL），搖勻，置37℃恒溫水浴鍋過夜。酶解液加水定容至100 mL，濾紙過濾，取濾液過0.45 μm濾膜待測。

HPLC條 件： C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙酸鈉溶液（0.05 mol/L），甲醇溶液（65：35）；流速，1 mL/min；柱溫：30℃；激發波長462 nm，發射波長522 nm。

1.3 標準物質制備

經篩查，選取一款市售奶粉，將奶粉均勻化并分裝為30克/瓶的包裝，置于棕色廣口瓶中，密封，低溫保存。

1.4 標準物質定值

國內10家權威實驗室采用HPLC法聯合定值，向各機構隨機發送2個包裝樣品，每個包裝取3個子樣，測定平均值作為檢測結果。按ISO Guide 35(2006)，對定值結果統計分析。

1.5 均勻性檢驗

隨機抽取15個包裝，進行瓶間均勻性檢驗；每個包裝取2個子樣，進行瓶內均勻性檢驗。用方差分析法判別標準物質均勻性。

1.6 穩定性考察

按照先密后疏的原則，在一定時間間隔內選擇定值方法檢測在規定條件下保存的標準物質量值隨時間的變化情況。用t檢驗法判別標準物質均勻性。

長期穩定性：標準物質置于-20℃儲存，分別在第1、2、3、5、7個月進行穩定性監測。每次取5個包裝，每個包裝取一個子樣，測3次，計算平均值，5個包裝測定結果平均值作為檢測結果。

短期穩定性：各隨機抽取5個包裝分別置于60℃烘箱（模擬運輸最高溫度）和-30℃冷凍箱（模擬運輸最低溫度），分別在第1、7、13、19天取出進行穩定性監測。檢測方法與長期穩定性檢測相同。

1.7 不確定度評價

1.7.1 均勻性與穩定性相對不確定度

用均勻性、穩定性試驗的數據，分別計算均勻性、長期和短期穩定性引入的不確定度ubb、urel(lts)、urel(sts)。

1.7.2 定值過程引入的不確定度

由維生素B2標準品的相對不確定度urel(c)和聯合定值的相對不確定度u0rel(char)引入。

標準品的相對不確定度來源有：標準品質量引入的不確定度urel(m)；線性擬合引入的不確定度u1rel(C0)；標準品的不確定度u2rel(C0)；稀釋引起的不確定度urel(V0)。

1.7.3 擴展不確定

擴展不確定度通過均勻性、穩定性和合成定值過程對特性值總不確定度的貢獻來估算的。

式中，k=2，m為定值的總體平均值。

2 結果與分析

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2.1 定值結果

10家實驗室聯合定值結果和定值引入的相對不確定度見表1。統計分析，數據全部服從正態分布，格拉布斯法檢驗未發現異常值且無顯著性差異，柯克倫法等精度檢驗數據是等精度的，即定值結果的總體平均值為標準物質的定值結果。

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2.2 均勻性檢驗

均勻性檢驗結果及其引入的不確定度ubb的結果見表2。F值＜F0.01(14，15)=3.75，表明在0.01顯著性水平標準物質中維生素B2含量是均勻的。

2.3 穩定性考察

標準物質長期、短期穩定性考察結果及其引入的不確定度結果見表3和4。結果t值均小于臨界值t(0.05，4)=2.776，認為標準物質是穩定可靠的。

2.4 不確定度評價

2.4.1 定值過程引入的不確定度

標準物質定值過程引入的不確定度結果見表5。

2.4.2 擴展不確定度

按式（3）計算標準物質的擴展不確定度為UCRM=2.445，本文研制的奶粉中維生素B2標準物質定值結果為15.7±2.4 mg/kg（k=2）。

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3 結論

本文研制的奶粉中維生素B2標準物質，定值結果準確可靠，并進行了均勻性檢驗、穩定性考察和不確定度評價，確保在不同時間、使用不同包裝的該種標準物質，所使用的量值及不確定度是準確可靠的。