固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜法測定植物性食品中鏈霉素與雙氫鏈霉素

李敏青，徐 娟*，王 嵐，安文佳，孫靈慧，何曼莉

(1.廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

鏈霉素、雙氫鏈霉素是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，雙氫鏈霉素是將鏈霉素中鏈霉糖部分的醛基氫化后所獲得的另一種鏈霉素衍生物，與鏈霉素有相似的功效。兩者常被用于治療細菌性感染，是防治果樹火燒病的植物保護劑，可有效防治植物細菌病害，如蘋果和梨的火疫病、黃瓜角斑病、菜豆霜霉病、芹菜細菌性疫病[1]。其作用機制為通過抑制肽鏈延長阻礙細菌合成蛋白質并致其死亡。但兩者具有嚴重的耳毒性及腎毒性且易引發過敏反應，歐盟、美國、日本和中國香港等國家和地區均規定了其最大殘留限量[2]。其中，中國《GB 2763-2016 食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》和歐盟標準對植物性食品中鏈霉素、雙氫鏈霉素不作最大殘留限量要求，而日本肯定列表和新西蘭最大殘留限量法則規定植物性食品計算鏈霉素殘留量時應將雙氫鏈霉素一同計入，因此在殘留檢測中應同時檢測二者[3]。另外，中國香港《食物內殘余除害劑規例》和美國最大殘留限量標準對仁果類水果、土豆、芹菜、番茄、(甜)辣椒、干扁豆、紅豆中鏈霉素或雙氫鏈霉素的限量要求為0.25～0.50 mg/kg[4]。

目前，國內外對于鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢測方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6]、氣相色譜-質譜法[7]、液相色譜法[8-9]和液相色譜-質譜法(LC-MS/MS)[10-15]等。其中LC-MS/MS技術兼具靈敏度高、選擇性強的優勢，廣泛應用于鏈霉素和雙氫鏈霉素藥物的分析，并取得了很好的效果，逐漸成為鏈霉素和雙氫鏈霉素藥物殘留確證分析的主要方法。我國現行的檢測鏈霉素和雙氫鏈霉素的國家標準以及現有文獻所涉及基質多為蜂王漿、奶制品、水產品、飼料、肉制品以及番茄制品、花粉等[16-20]，尚未見蔬菜、水果以及糧谷中鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢驗方法或標準?；诖?，本文采用高效液相色譜-串聯質譜技術建立了一種適用于多種蔬果及糧谷樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留的檢測方法，以期為該藥劑在植物生態系統中的合理安全用藥提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantiva液相色譜-串聯三重四極桿質譜聯用儀，配備電噴霧電離源(ESI)(美國Thermo Fisher公司)；Milli-Q高純水發生器(美國Millipore公司)；XP205分析天平(感量0.01 g和0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；MiltiReax型渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)；Promax-2020型水平往復振蕩器(德國Heidolph公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；甲酸銨(色譜純，上海CNW公司)；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸、乙酸(分析純，廣州化學試劑廠)；WCX固相萃取柱(60 mg，Waters公司)；鏈霉素、雙氫鏈霉素標準物質(純度≥98.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)；有機微孔濾膜(0.22 μm，津騰公司)；實驗用水為經Milli-Q純水系統制備的超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

標準儲備液：分別準確稱取適量鏈霉素、雙氫鏈霉素標準品，用水配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液，于0～4 ℃避光保存。準確移取一定體積的鏈霉素、雙氫鏈霉素的標準儲備液，用水稀釋配成10 mg/L混合標準工作液，現用現配。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件Atlantis Hilic Silica色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm)；柱溫:40 ℃；進樣量:5 μL；流速:0.3 mL/min；流動相為乙腈(A)-0.1 mol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)溶液(B)(體積比1∶1)，等度洗脫8 min。

1.3.2 質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描，多反應監測模式(MRM)；電噴霧電壓：3 500 V；鞘氣(氮氣，純度>99.99%)：40 Arb，輔助氣(氮氣，純度>99.99%)：8 Arb，吹掃氣(氮氣，純度>99.99%)：1 Arb；離子源溫度(TEM)：350 ℃；傳輸管溫度(TEM)：350 ℃。鏈霉素和雙氫鏈霉素的保留時間、母離子和碎片離子、碰撞能量以及去簇電壓參數見表1。

表1 鏈霉素和雙氫鏈霉素的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of streptomycin and dihydrostreptomycin

*quantitation ion

1.4 樣品前處理

1.4.1 提 取稱取約5.0 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL具塞塑料離心管中，蔬果樣品加入12 mL提取溶劑(0.02 mol/L磷酸氫二鈉溶液，用磷酸調至pH 7.0)，振蕩提取10 min，以4 500 r/min離心5 min，收集提取液于25 mL塑料容量瓶中，殘渣再加入10 mL提取溶劑重復提取一次，合并提取液并用提取溶劑定容至25 mL，待凈化；豆類(干)樣品加入25 mL提取溶劑，振蕩提取10 min，以4 500 r/min離心5 min，待凈化。

1.4.2 凈 化將弱陽離子交換柱WCX依次用3 mL甲醇、3 mL水活化后，移取上述5 mL樣液上柱，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，棄去所有流出液，再用4 mL乙腈-2%乙酸溶液(體積比1∶4)洗脫，收集洗脫液并定容至5 mL，渦旋混勻，吸取1.5 mL溶液于微型高速離心管中，以12 000 r/min離心5 min，取上清液過濾膜至進樣瓶中，供LC-MS/MS分析測定。

1.4.3 基質提取標準工作液的制備稱取5份約5 g(精確至0.01 g)陰性試樣于50 mL具塞塑料離心管中，分別加入不同體積的混合標準工作液，余下操作同“1.4.1”和“1.4.2”所述，得到最終的定容質量濃度分別為10、25、50、100、120 μg/L的基質提取標準工作液。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇由于鏈霉素和雙氫鏈霉素是強極性物質，易溶于水，難溶于大多數有機溶劑，常用的提取試劑有磷酸溶液和磷酸鹽緩沖溶液。因此，實驗考察了水、稀磷酸溶液(pH 1.96)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)以及磷酸鹽緩沖液+庚烷磺酸鈉(0.025 mol/L磷酸鈉+0.05 mol/L庚烷磺酸鈉) 4種溶劑的提取效果。結果發現，用水和稀磷酸進行提取時的回收率較低(小于40%)，且目標物的峰形和靈敏度均不理想；而磷酸鹽緩沖溶液對樣品的酸堿性有一定緩沖作用，用磷酸調至pH 7.0時，能保持鏈霉素和雙氫鏈霉素以穩定陽離子狀態存在，有利于后續SPE柱凈化時的離子交換。結果顯示，磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)對鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取效率更高，而磷酸鹽緩沖溶液添加庚烷磺酸鈉后對目標化合物的回收并無明顯優勢，因此，本文選擇磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式的選擇目前食品檢測中常用的提取方法有勻漿提取、渦旋提取、超聲提取、振蕩提取、強化溶劑萃取等，基于本方法的檢測對象為蘋果、土豆、芹菜、番茄、(甜)辣椒、干扁豆，且綜合考慮操作時間，采用添加回收實驗分別對超聲提取和振蕩提取進行了比較。結果顯示，對樣品進行批量處理時，超聲提取的樣品回收率穩定性較差，這可能是超聲過程中的水溫未能持續保持在常溫下所致，因此本實驗選擇振蕩提取。

2.1.3 凈化小柱的選擇已有文獻和標準中檢測鏈霉素和雙氫鏈霉素時多采用反相C18柱、離子交換柱或反相固相萃取柱串聯離子交換柱凈化，因此，本實驗考察了C18柱、MCX(強陽離子交換)柱、WCX(弱陽離子交換)柱以及反相固相萃取柱串聯WCX柱的凈化效果。4種SPE柱均依次加入甲醇、水進行活化后，移取樣液上柱，對于MCX柱、WCX柱和HLB串聯WCX柱依次加入水和甲醇進行淋洗，C18柱則依次加入水和叔丁基甲基醚-正己烷(4∶1，體積比)進行淋洗，棄去所有流出液，C18柱和MCX柱分別加入甲醇和5%氨水甲醇進行洗脫，而WCX柱和HLB串聯WCX柱則加入2%甲酸甲醇進行洗脫，收集濾液并定容，供LC-MS/MS分析測定。結果顯示，WCX柱比C18柱、MCX柱對目標分析物的選擇性更強，保留能力更佳，回收率及凈化效果更好。另外，比較了單一WCX柱和采用反相固相萃取柱串聯WCX柱兩種凈化方式，發現兩者的回收率和凈化效果相差不大，均能滿足凈化要求。相比于雙柱凈化，單柱凈化簡化了操作步驟，節省了分析時間及大量溶劑，具有簡單、快速、凈化效果好、回收率高等優點。因此，在滿足本實驗檢測要求的前提下，并綜合考慮檢測成本，最終確定WCX柱作為凈化小柱。

2.1.4 洗脫液的選擇WCX(弱陽離子交換)柱中待測物的洗脫常用酸性甲醇溶液，若酸含量太少，不利于待測物洗脫，而酸的含量太多又可能會有較多的干擾物被洗脫下來。因此，實驗考察了2%甲酸甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇以及乙腈-2%乙酸溶液(1∶4，體積比) 4種溶劑的洗脫效果。結果表明，目標物回收率未隨溶劑中甲酸含量的升高而提高，4種溶劑洗脫效果相當，由于Atlantis Hilic Silica色譜柱在使用時應盡量避免使用甲醇。因此，實驗選用乙腈-2%乙酸溶液進行洗脫。

圖1 Atlantis Hilic Silica色譜柱對鏈霉素和雙氫鏈霉素分離的色譜-質譜圖Fig.1 Separation of streptomycin and dihydrostreptomycin by Atlantis Hilic Silica chromatographic column

2.2 色譜-質譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇鏈霉素和雙氫鏈霉素屬于堿性化合物，易溶于水，極性強，在傳統的反相色譜柱上幾乎無保留。已有文獻大多采用離子對色譜分析方法，即在流動相中加入離子對試劑增加被測化合物的保留以獲得滿意的分離效果，但采用液相色譜-質譜法時，即使離子對試劑是易揮發的(如七氟丁酸)依舊難以避免其在質譜系統殘留產生離子抑制作用，特別是對負離子檢測模式的影響更加嚴重，且使用完離子對試劑后需長時間清洗方可使質譜儀恢復正常，在便捷性上具有較大局限。本研究采用Spursil-C18(150 mm×4.6 mm,3 μm)、Inertsil ODS-4(150 mm×2.1 mm,3 μm)以及親水作用的正相硅膠柱Atlantis Hilic Silica(100 mm×3.0 mm,3 μm) 3種色譜柱在各自適用的優化色譜條件下對鏈霉素和雙氫鏈霉素標準溶液進行測定。結果顯示：鏈霉素在Spursil-C18柱上的峰形很差，且響應及靈敏度低；在Inertsil ODS-4色譜柱上幾乎無保留，約在0.7 min時即出峰；而在親水作用的正相硅膠柱Atlantis Hilic Silica上的保留較好，出峰時間約在4.6 min(圖1)，因此選擇Atlantis Hilic Silica色譜柱進行實驗。

2.2.2 流動相的選擇由于本研究采用Atlantis Hilic Silica色譜柱進行分離，且在正離子模式下檢測，依據Waters公司推薦，有機相常用乙腈溶液，水相一般為乙酸銨或甲酸銨的水溶液、乙酸或甲酸的水溶液，或者鹽和酸同時使用的水溶液。由于液相色譜-質譜聯用中鹽的使用通?？筛纳拼郎y物的峰形和靈敏度，因此實驗考察了不同濃度(0.005、0.01、0.1 mol/L)甲酸銨和0.1%甲酸水溶液為水相時的檢測效果，發現甲酸銨濃度為0.1 mol/L時，待測物的響應比0.01 mol/L時更高，且峰形更對稱不拖尾，因此選擇甲酸銨濃度為0.1 mol/L。另外，質譜中測定正離子時，添加酸有利于提高待測物的離子化效率，提高檢測靈敏度。實驗考察了不同甲酸含量(0.1%、0.2%)對實驗的影響，結果顯示，甲酸含量為0.2%時，待測物的峰形拖尾明顯，靈敏度更低，且過多的酸會損害色譜柱和質譜儀。因此，選擇流動相為乙腈-0.1 mol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)溶液。此外，實驗過程中還發現采用Atlantis Hilic Silica色譜柱進行梯度洗脫時，如果下一針沒有達到流動相充分平衡，該柱的柱殘留效應會很強，難以獲得良好的重現性，需多次用空白溶液進樣方式洗針方能消除上一針殘留，因此，為消除柱殘留效應以獲得良好的重現性，流動相采用等度洗脫。

2.2.3 質譜條件的優化根據歐盟(2002/657/EC)指令規定，質譜聯用檢測應在確定母離子的基礎上選擇2個以上的子離子。通過對鏈霉素和雙氫鏈霉素的標準溶液進行一級質譜全掃描，確定其分子離子峰[M+H]+分別為m/z582.2和m/z584.3，再對分子離子峰進行二級質譜全掃描，發現鏈霉素的主要特征碎片為m/z263.0、246.0，雙氫鏈霉素為m/z263.0、246.1。同時對碰撞氣能量、毛細管電壓和去簇電壓等質譜參數進行了優化，結果見表1。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線、線性范圍與定量下限本實驗采用陰性蘋果加標0.25 mg/kg樣品(重復6次測定)分別考察了在標準溶液工作曲線、基質匹配工作曲線和基質提取標準工作曲線3種曲線下的平均回收率(基質匹配工作曲線是指在樣品處理后，最終定容時加入各濃度標準溶液；基質提取標準工作曲線則是指在樣品稱樣后即加入各濃度標準溶液，按樣品處理)。實驗結果表明，6份樣品以標準溶液曲線計算得鏈霉素和雙氫鏈霉素的絕對平均回收率為33%和36%，以基質匹配曲線計算分別為55%和62%，而以基質提取標準曲線計算為92.3%和100%。由此可見，植物性食品中的基質效應非常明顯，并且食品在提取和凈化前處理過程中也存在較大損失，目前由于未能找到合適的內標物來校正鏈霉素和雙氫鏈霉素，因此采用基質提取標準溶液考察其標準曲線。分別配制質量濃度為10、25、50、100、120 μg/L的鏈霉素和雙氫鏈霉素基質提取標準工作液(見“1.4.3”所述)，以待測物峰面積對其質量濃度繪制標準曲線，鏈霉素和雙氫鏈霉素在蘋果、芹菜、甜椒、干扁豆中的標準曲線見表2。結果表明，4種基質下的鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性良好(r2≥0.999)。以方法的最低添加水平作為定量下限[21]，得鏈霉素和雙氫鏈霉素定量下限為0.125 mg/kg，低于中國香港《食物內殘余除害劑規例》的最大殘留限量0.25 mg/kg[4]。

2.3.2 回收率與相對標準偏差實驗以蘋果、芹菜、甜椒、干扁豆為空白樣品基質，分別進行125、250、500 μg/kg 3個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度平行實驗6次，在優化條件下測定。結果顯示，鏈霉素和雙氫鏈霉素在3個濃度水平下的平均回收率為83.6%～101%，相對標準偏差(RSD)為2.3%～7.6%，由此可見，通過基質提取標準曲線校正后均可達到規定的回收率要求，能夠滿足鏈霉素和雙氫鏈霉素同時分析的要求?？瞻滋O果樣品中添加125 μg/kg鏈霉素和雙氫鏈霉素的MRM圖見圖2。

表2 不同植物性食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性方程、相關系數及加標回收率與相對標準偏差(RSD,n=6)Table 2 Regression equations，correlation coefficients，average recoveries and relative standard deviation(RSD,n=6)

圖2 空白蘋果樣品中添加125 μg/kg鏈霉素(A)和雙氫鏈霉素(B)的MRM譜圖

2.3.3 實際樣品檢測采用本方法對市售蔬菜(芹菜、甜椒和黃瓜)、水果(蘋果、梨和西紅柿)、糧谷(紅豆和扁豆)共30個樣品進行鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留測定，結果顯示，在所有樣品中均未檢出鏈霉素及雙氫鏈霉素殘留。

3 結 論

本研究建立了植物性食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的固相萃取/高效液相色譜-串聯質譜測定方法。該方法采用單柱凈化，具有樣品前處理簡單，線性范圍寬，重現性好等特點。方法采用WCX固相萃取柱富集凈化，乙腈-2%乙酸水溶液洗脫，成本低，效果穩定，經親水作用HILIC色譜柱分離，能避免離子對試劑抑制離子化效率，提高靈敏度，有效排除了復雜基質對目標物的干擾并滿足目標物的定性和定量檢測要求。