陳志雄 胡志剛 王洪洋 張鶯鶯 曹建國 吳華莉 談永松 涂尾龍
摘 ?要:為研究分析實驗用小型豬封閉群中肥胖(Obese,OB)基因型,本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術檢測了實驗用小型豬封閉群核心群中30頭小型豬的OB基因。結果表明,OB基因有三種基因型:AA\AB\BB,在30個檢測個體中,5個個體為AA基因型,19個個體為AB基因型,6個個體為BB基因型。
關鍵詞:小型豬;肥胖基因;多態性;聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術
中圖分類號:S813.1 文獻標志碼:A 文章編號:1001-0769(2019)06-0019-03
實驗用小型豬是我國寶貴的物種資源,也是現代生物醫學中應用最廣的實驗動物之一。由于小型豬體型小,操作方便,同時小型豬的血液生理生化指標和人的比較接近,皮膚等器官和人的比較相似,就目前來說小型豬應該是人類疾病動物模型的最佳實驗動物。作為實驗豬,小型豬的體型對實驗操作者來說尤為重要。在對小型豬進行育種的時候,所采用的方法與商品豬的不一樣,并不是挑選體型大的留種。因此,研究小型豬肥胖基因對于小型豬育種非常重要。
肥胖(Obese,OB)基因在調控實驗豬繁殖和采食等代謝方面發揮著極其重要的功能,其表達的產物是調控動物機體能量平衡和脂肪細胞分泌的重要作用。豬OB基因由3個外顯子和2個內含子組成,定位于18號染色體上,5端是97 bp的先導序列,3端是3.7 kb的非編碼序列。目前,OB基因一直是國內外學者的重要研究方向,有研究表明該基因的多態性和豬的多個性狀相關,如肉質性狀和繁殖性狀等。由于我國對實驗用小型豬的研究起步較晚,因此有關實驗用小型豬OB基因的研究鮮見報道。本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法檢測實驗用小型豬OB基因的多態性,為實驗用小型豬育種提供分子標記輔助育種,積累實驗用小型豬的基礎資料,更好地對實驗用小型豬選種選育。
1 ?材料與方法
1.1 試驗試劑
本次試驗的常用試劑:2×Taq Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號:P112;Pvu Ⅱ和Hinf Ⅰ購自New England Biolabs公司,貨號分別為:R0151S和R0155T;DL2000 DNA Maker購自上海翊圣生物科技有限公司,貨號:10501ES60;血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,貨號:DP304。
1.2 試驗動物
試驗動物選自上海市農業科學院實驗用小型豬封閉群核心群中30頭實驗用小型豬,年齡在2~3月。
1.3 試驗方法
1.3.1 豬耳朵組織基因組提取
試驗時稱取0.3 mg豬耳朵組織,將其放入組織破碎機中破碎,將破碎的組織樣品放入1.5 mL的EP管中,使用天根公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA,并將30個樣品分別標記。
1.3.2 OB基因3 469位點檢測(PCR-RFLP)
設計針對OB位點的引物,并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
OB-F:5-GAG CCA ACA TCT CTC TCG CTG AG -3
OB-R:5-GAC TCC TGG AAG CTC AGG TTT CTT C-3
1.3.3 PCR反應體系
按照表1配置PCR反應體系。
94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。
1.3.4 酶切反應體系
酶切反應體系如表2所示。酶切溫度37 ℃,時間30 min。
2 ?結果
2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測
配置3%瓊脂糖凝膠,電壓120 V,時間12 min,結果如圖1、圖2和圖3所示。
2.2 統計基因型
從酶切結果條帶分析,實驗用小型豬OB基因的基因型如表3所示。
3 ?討論與分析
嚴燕等對圩豬OB基因單核苷酸多態性檢測發現,OB基因存在C/T、A/G、C/T和G/T這4個多態位點,群體存在A和B等位基因,表現3種基因型:AA\AB\BB。Jiang等研究發現,4個多態位點分別位于867 bp、1 112 bp、3 469 bp和3 714 bp處。OB基因目前在動物體內有著非常廣泛的生理功能,不僅會影響動物的許多疾病,還與非常多的經濟性狀相關聯。Stephens對豬染色體研究發現,OB基因定位于18號染色體上,與已有研究的神經肽Y(NeuroPeptide Y,NPY)基因表達產物NPY一樣,都能增強促黃體素(Luteinizing Hormone,LH)的釋放,對豬的繁殖性能有很大的影響。但是,在小型豬方面,和肥胖相關的OB基因鮮見報道。本研究重點對實驗用小型豬的OB基因多態性進行了檢測,在30個個體中,5個個體為AA基因型,19個個體為AB基因型,6個個體為BB基因型。檢測主要是為了填補實驗用小型豬基礎資料,并為小型豬選育選種提供分子標記輔助育種。由于實驗用小型豬封閉群數量有限,需要等封閉群數量擴大,下一步對群體進行OB基因檢測,對基因型頻率進行檢測,更進一步的掌握實驗用小型豬的OB基因型,為小型豬選育更適合實驗動物提供有力支撐?!酢?/p>
參考文獻:(6篇,略)