耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥機制及流行特征研究

徐偉軍 潘輝 陳西佳 趙褀

碳青霉烯類抗生素因其抗菌譜廣、抗菌活性強、對ESBLs穩定及毒性低等優點，一直作為ESBLs菌株嚴重感染患者的首要選擇，曾被稱為臨床治療陰性菌所致嚴重感染的“最后一道防線”［1］。但近些年隨著碳青霉烯類抗生素在臨床的廣泛使用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的報道越來越多［2］。其中KPC型碳青霉烯酶于2001年美國首先報道在肺炎克雷伯菌中發現的一種絲氨酸酶［3］，能夠水解亞胺培南、美羅培南和頭孢菌素等多種臨床常用一線抗菌藥物，從而導致細菌多重耐藥，對人類健康造成了嚴重的威脅。有研究顯示［4］，KPC基因位于質粒上，易在同一菌種不同菌株甚至不同菌種之間移動，造成局部暴發甚至世界范圍內的擴散。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）在巴西、中國臺灣、日本、古巴等多個地區均有分離［5-8］。本研究對本院臨床標本中CRKP的藥物敏感性進行分析，以了解其耐藥機制和流行特征。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 分離本院2017年1月至2018年6月臨床標本中CRKP共189株。126株分離自痰液，23株分離自分泌物，20株分離自尿液，13株分離自全血，1株分離自腦脊液，6株分離自導管尖端。

1.2 試劑和儀器 Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定儀（法國bioMérieux公司），PCR擴增儀、Rotaphor System 6.0 脈沖場凝膠電泳儀、UVIBand PFGE 圖像分析軟件及紫外成像系統（德國Biometra公司），細菌多點接種儀（日本Oriental Motor公司），Taq酶及PCR相關試劑（日本TaKaRa），亞胺培南、美羅培南、厄他培南紙片（英國Oxoid公司），瓊脂糖電泳儀。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 分離的細菌由Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定儀進行菌種鑒定及藥敏試驗。碳青霉烯類抗生素藥敏采用瓊脂稀釋法測定其最低抑菌濃度（MIC）。根據美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI，2016）的解釋標準判斷藥敏試驗結果。

1.4 細菌耐藥基因PCR擴增及序列分析 細菌基因組DNA提?。焊鶕a品說明書，通過水浴裂解、去蛋白、異丙醇沉淀和洗脫等步驟完成基因組DNA快速抽提。PCR反應體系為：引物各10pmol，含MgCl2的 dNTP8μl，10×Buffer 2 5μl，Taq 酶 0.5μl，0.1μg基因組DNA，無菌純水補足至50μl。PCR反應條件為：94℃ 4min，1個循環；94℃ 1min，退火1min，72℃延伸1min，35個循環；72℃充分延伸5min，1個循環。PCR產物在含EB的1.0%瓊脂糖凝膠上100V恒壓電泳30min，紫外燈下觀察結果。PCR產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。所得DNA序列與GenBank中的數據庫進行比對，確定耐藥基因型。耐藥基因的引物序列、擴增長度等相關信息見表1。

表1 耐藥基因PCR擴增所用序列

2 結果

2.1 CRKP藥敏結果 本研究共分離到CRKP 189株，對亞胺培南耐藥或中介耐藥（MIC：2～128mg/L），對美羅培南和厄他培南均為耐藥（MIC：4～128mg/L）。CRKP對頭孢菌素、氨曲南、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、和左氧氟沙星呈高水平耐藥，對多粘菌素E、替加環素敏感性較高（見表2）。

表2 肺炎克雷伯菌藥物敏感試驗結果（%）

2.2 耐藥基因檢測結果 189株肺炎克雷伯菌均產KPC-2型碳青霉烯酶，未檢出NDM與IMP型金屬β-內酰胺酶，其中5株同時產VIM-1型金屬β-內酰胺酶，blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV檢出率均＞60%。見表3。

表3 耐藥基因檢測結果分析

2.3 染色體DNA同源性分析 應用UVIBand軟件對PFGE條帶進行分析顯示，共有2種分型（a型、b型），其中a型較多，占67.9%。（見圖1）。

3 討論

圖1 肺炎克雷伯菌染色體D N A脈沖場凝膠電泳（PFGE）結果

臨床研究顯示，大部分產blaKPC肺炎克雷伯菌分離自入住ICU 病房、患有心腦血管疾病的老年患者，提示這類患者是感染或攜帶產KPC-2肺炎克雷伯菌的高危人群［9］。本研究收集到攜帶CRKP的患者中106例來自ICU，20例來自腦外科，33例來自呼吸內科，患者的平均年齡為67歲，＞50歲者占82%。符合這些條件的患者基礎疾病較多，免疫力低下，時常需要靜脈置管、氣管插管等侵入性操作，進一步增加了感染的可能［10］。

從藥物敏感試驗發現，189株CRKP對除多粘菌素E和替加環素以外的其他抗生素表現出較高的耐藥性。但有部分菌株對亞胺培南和美羅培南為中介耐藥，甚至有些菌株處于敏感范圍，因而極易導致這類菌株被漏檢，容易誤導臨床的抗菌藥物選擇，造成院內感染的隱性傳播。而且這些菌株常同時產其他β-內酰胺酶，從而對多種抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來了一定的困難，臨床應及時選擇相應藥物進行治療［11-12］。

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制包括產碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶過度表達伴外膜蛋白缺失或數量減少［13-14］、青霉素結合蛋白親和力的改變［15］、主動外排泵活躍等，其中產碳青霉烯酶是最常見的耐藥機制，包括A類、B類、D類碳青霉烯酶，其中KPC-2型碳青霉烯酶最多見［16-17］。自2001年美國報道首例產KPC-2肺炎克雷伯菌以來，產KPC菌株迅速向其他國家播散。在中國，浙江學者于2007年首次報道了產KPC-2酶肺炎克雷伯菌，此后在全國各地陸續也有報道，但暴發流行以經濟發達省市多見。本研究收集本院189株CRKP，基因擴增顯示均為產KPC-2肺炎克雷伯菌，還有5株同時產VIM-1。VIM金屬β-內酰胺酶是一種能水解幾乎所有（除氨曲南等單環外）的β-內酰胺類抗生素，也是已報道金屬酶中與新德里金屬β-內酰胺酶（NDM-1）序列相似性最高的一類獲得性金屬β-內酰胺酶，其基因位于整合子上，可造成不同種細菌間的水平傳播和擴散［18］，需要引起注意。

綜上所述，本院有可能發生過一次產blaKPC-2肺炎克雷伯菌的傳播流行，從而導致分離的CRKP均產KPC-2碳青霉烯酶。因此預防控制醫院感染非常重要，如早期監測、加強臨床抗菌藥物的管理、加強醫院消毒滅菌的監督管理、加強醫務人員手的清潔與消毒、加強醫源性傳播因素的監測與管理、對易感人群實行保護性隔離、及時總結與反饋臨床上分離的病原體及其對抗菌藥物的敏感性、開展醫院感染的宣傳教育等。