共有峰率和變異率雙指標序列分析法分析云南產瑪咖的紫外光譜

王瀚墨，李智敏，王元忠，肖 丹,2

(1. 云南省農業科學院 藥用植物研究所,云南 昆明 650223； 2. 云南良旺生物科技有限公司,云南 昆明 650106)

瑪咖(Maca，LepidiummeyeniiWalp.)，十字花科獨行菜屬植物，原產南美秘魯安第斯山區海拔 3 500～4 000 m的區域.它的貯藏根曾被秘魯當地人用于營養補充、加強體質和提高生育能力等，甚至在當地成為等價交換的中介物[1].現代研究表明，瑪咖中的瑪咖烯、瑪咖酰胺、芥子油苷以及固醇等活性成分具有改善記憶障礙[2]、改善更年期婦女心理癥狀和性功能障礙[3]、改善性能力[4]、增加骨密度[5]、提高精子生成數量[6]、減少前列腺增生[7]、抗氧化、修復紫外線傷害皮膚[8]、抗疲勞等功能[9].同時瑪咖富含蛋白質、氨基酸、脂肪、微量元素等多種人體必需營養成分.2002年瑪咖僅在美國和日本銷量就達到20億美元，同年瑪咖被引入中國云南、新疆等地進行實驗性種植.2011年我國衛生部正式批準瑪咖粉作為新資源食品.

目前云南已建成全國最大的瑪咖規?；N及種植基地，推廣栽培已達10萬畝，產量占據全國的95%以上.麗江、中甸、昭通以及怒江、昆明的部分地區均有種植，但品質略有參差.為使瑪咖的鑒別及質量得到有效控制.本文采用氯仿快速提取法，并用三組平均值、四點平滑、一次微分等方法校準和排除干擾，利用共有峰率和變異峰率雙指標系列法分析云南地區不同產區瑪咖紫外指紋圖譜相似性.結果表明，該方法具有穩定性高、重現性好等特征，為快速、準確鑒別云南不同產區瑪咖，品質評價提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

其中前10份瑪咖樣品采集于云南省瑪咖各主要種植區，所有瑪咖樣品均選擇各地瑪咖平均大小的個體并將其混合磨粉.P號樣品購自秘魯，見表1.

1.2 主要儀器與試劑

UV-2550雙通道紫外可見分光光度計(島津公司，配有UV probe工作站)；SY3200-T型超聲波清洗機(上海聲源超聲儀器設備有限公司)；AR1140型萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；FW-100型高速粉碎機(天津市華鑫儀器廠)；九陽JYL-C012多功能料理機(九陽股份有限公司)；0.301 mm標準篩盤(浙江上虞市道墟五四儀器廠)；130 mm陶瓷研缽.

表1 樣品來源

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇(均為AR)；濃鹽酸、氫氧化鈉(均為CP)；二次蒸餾水.

1.3 紫外光譜測試樣品制備及測定條件

樣品50 ℃烘干，粉碎，研細使其全部通過0.301 mm標準篩，保存于自封袋內備用.準確稱取1.500 g樣品于25 mL比色管中，加入20 mL提取溶劑，室溫超聲提取40 min，經3層濾紙獲得待測試樣品.以所選溶劑作為參比液，設定掃描波長為200～600 nm，重復3次，狹縫1.0 nm，采樣間隔0.2 nm進行紫外光譜測定.

1.4 紫外光譜處理

所測瑪咖紫外原始光譜依次進行3組平均，4點平滑，1次微分處理，以濾除光譜噪音，校準基線，提高圖譜分辨率和測定準確度[10].

2 方法與結果

2.1 最佳提取溶劑和提取時間

以秘魯產瑪咖P號樣品為對象，分別使用石油醚、石油醚與氯仿混合液(V∶V=1∶1)，氯仿、氯仿與乙酸乙酯混合液(V∶V=1∶1)、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇和雙蒸水作為溶劑，料液比0.020、0.025、0.030、0.040、0.050、0.075、0.100、0.200、0.300 g/mL，超聲時間0、10、20、30、40、50、60 min交叉進行紫外測定，以1.3節方法測定3次，并以1.4節方法對結果進行處理.篩選溶液實驗紫外光譜結果見圖1.

結果表明，氯仿作為提取溶劑，料液比0.075 g/mL，超聲時間40 min提取瑪咖紫外吸收峰數明顯多于或等于其它溶劑、料液比和超聲時間提取的吸收峰數.

2.2 穩定性實驗

取一份保存在0～5 ℃的樣品3提取液，分別在2、4、6、8、10 h時進行紫外光譜測定，光譜數據經1.4處理后8 h以吸收波長計算的RSD%在0.06%～2.33%之間.結果表明，該方法在8 h內樣品保持穩定.

2.3 重現性實驗

以樣品3為考察對象，稱取0.100 0 g樣品5份，以氯仿為溶劑1.3法制取測試液并進行紫外光譜掃描，光譜數據經1.4處理后以吸收波長計算平均相對標準偏差RSD%在0.09%～1.81%之間，表明該方法重現性好.

2.4 云南地區不同產區瑪咖紫外指紋圖譜

通過2.1～2.3節實驗，本研究最終選用超聲40 min，料液比0.075 g/mL的瑪咖氯仿提取液作為紫外光譜檢測的制備液.云南地區不同產區瑪咖紫外指紋圖譜見圖2.

2.5 紫外指紋圖譜共有峰和變異峰的確定

本研究采用W正態分布檢驗不同紫外光譜中的共有峰.對于不符合正態分布，又十分接近的一組吸收峰，則采用組內各吸收峰波長的極差值與本組及相鄰組之間的平均波數差值進行比較，當極差值顯著小于平均波數值時視為一組共有峰，反之視為變異峰[10].瑪咖紫外指紋圖譜吸收峰波長數據及共有峰的識別，見表2.

序號吸收峰波長λ/nm1238.60 219.40 207.60 203.60 2276.00238.20 220.80 216.20 213.20 210.80 204.20 202.40 3211.60 208.80 4275.40241.00 213.60 208.80 206.80 200.20 5275.20241.80 217.80 206.80 204.40 200.60 6303.20240.00 224.60 217.40 211.40 206.80 204.20 7225.40 221.60 216.20 211.00 204.60 8223.60 216.80 212.60 210.00 207.00 9279.00241.80 227.00 225.40 221.00 214.80 209.60 206.60 10259.40229.40 226.00 220.40 214.20 210.40 208.20 P276.80275.00222.80 217.80 212.80 210.40 207.60

注：在表中屬于同一列的吸收峰為共有峰.

不同產區瑪咖紫外指紋圖譜雙指標序列分析結果計算紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率使用公式如下[11]：

共有峰率P=Ng/Nd×100%,

(1)

變異峰率Pva=na/Ng×100%,

(2)

Pvb=nb/Ng×100%,

(3)

其中：Ng代表2個圖譜中共有峰數，Nd代表獨立峰數(Nd=Ng+na+nb)，Pva代表a圖譜的變異峰率，na代表a圖譜的變異峰數，Pvb代表b圖譜的變異峰率，nb代表b圖譜的變異峰數.

對云南地區不同產區瑪咖紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析結果如表3.

表3 樣品間的共有峰和變異峰率

續表3

序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)4∶940;50,1005∶P30;100,133.36∶P40;75,754∶837.5;100,66.75∶927.3;100,166.76∶137.5;133.3,33.34∶333.3;200,05∶125;200,1006∶236.4;75,1004∶630;100,133.35∶722.2;200,1506∶430;133.3,1004∶125;200,1005∶822.2;200,1506∶530;133.3,1004∶710;500,4005∶314.3;500,1006∶312.5;600,1007∶650;25,758∶1071.4;0,409∶666.7;33.3,16.77∶244.4;80,508∶962.5;0,609∶1066.7;33.3,16.77∶944.4;25,1008∶650;25,759∶P66.7;33.3,16.77∶842.9;66.7,66.78∶P50;25,759∶862.5;60,07∶1033.3;66.7,133.38∶742.9;66.7,66.79∶245.5;166.7,166.77∶P33.3;66.7,133.38∶340;150,09∶744.4;100,257∶128.6;150,1008∶437.5;66.7,1009∶440;100,507∶522.2;150,2008∶230;66.7,166.79∶133.3;166.7,33.37∶316.7;400,1008∶522.2;150,2009∶527.3;166.7,1007∶410;400,5008∶112.5;400,3009∶325;300,010∶871.4;40,0P∶966.7;16.7,33.310∶966.7;16.7,33.3P∶1055.6;40,4010∶462.5;40,20P∶250;250,166.710∶655.6;40,40P∶850;75,2510∶P55.6;40,40P∶444.4;75,5010∶250;250,166.7P∶640;75,7510∶733.3;133.3,66.7P∶733.3;133.3,66.710∶530;133.3,100P∶530;133.3,10010∶328.6;250,0P∶328.6;250,010∶122.2,250,50P∶122.2,250,50

注：*1∶6 37.5；33.3，133.3，這一數據表明：以1號樣品吸收峰為對照，用6號樣品吸收峰進行比較；比較結果顯示：1號樣品與6號樣品吸收峰的共有峰率為37.5%，1號樣品吸收峰的相對變異峰率為33.3%，6號樣品吸收峰的相對變異峰率為133.3%.從共有峰率和變異峰率綜合看，二者之間相似性較小，差異性較高.

表3結果表明，云南不同產區的瑪咖存在一定的差異，這種差異可以通過紫外指紋圖譜的樣品間的變異峰進行區分，而這種差異與產區間空間距離無關.同一地域產區瑪咖的紫外指紋圖譜比較，仍存在相似性較小，而差異性則較高的情況，如：香格里拉建塘與香格里拉小中甸樣品間比較(1∶2,33.3%，33.3%，166.7%)，昭通昭陽區與昭通大山包樣品間比較(3∶10,28.6%，0%，250%)，昆明東川與祿勸轎子雪山樣品間比較(4∶9,40%，50%，100%)，會澤大海鄉與會澤烏蒙山樣品間比較(5∶8,22.2%，200%，150%)，麗江巨甸與麗江云嶺樣品間比較(6∶7，50%，75%，25%).而如9號祿勸轎子雪山樣品(9∶P,66.7%)、10號昭通大山包樣品(10∶P，55.6%)、8號會澤烏蒙山樣品(8∶P,50%)和2號香格里拉小中甸樣品(2∶P，50%)的吸收峰與秘魯的P號樣品的吸收峰較為相似，但仍具有一定的差異性.

3 結語

在紫外條件下利用雙指標序列法，通過3組平均，4點平滑，1次微分處理建立了云南產瑪咖紫外指紋圖譜.該方法精密度高、穩定性好、重現性好，能準確定性反映任意2個樣品之間的相似和差異情況，同時能從整體上對其進行分組，與常用的模糊聚類相比更為客觀、直接，為農產品定性評價奠定了基礎.

紫外指紋圖譜顯示，云南不同產區瑪咖樣品間最大共有峰率達75%，最小共有峰率為0%，變異峰率最大為∞，最小為0%.瑪咖樣品紫外指紋圖譜可以有效的區分云南地區不同產區的瑪咖樣品.不同樣品間紫外指紋圖譜相似性程度與其產區間的距離無關，這可能與云南地區種植瑪咖時間短，瑪咖種源來源復雜以及云南地區小區域地理、氣候多元性有關.以樣品紫外吸收峰的共有峰率和變異峰率作為標志，祿勸轎子雪山樣品、昭通大山包樣品、會澤烏蒙山樣品和香格里拉小中甸樣品與秘魯產的瑪咖成分更為接近，但仍具有一定的可識別的差異性.以上數據將為云南地區瑪咖的產區鑒別，以及種源篩選和種植區域選擇提供一定的理論依據.