Spexin轉基因小鼠的構建及表型初步分析

楊春菊，莊 敏，賴 奇，尹俊林，樊保敏，卞兆祥,2，林成源，曾廣智

(1.云南民族大學 云南民族大學-香港浸會大學傳統天然藥物研發聯合實驗室,云南 昆明 650500； 2. 香港浸會大學 中醫藥學院，香港)

Spexin(SPX)，又名神經肽Q，是通過現代生物信息學技術發現并鑒定的神經肽[1-2].成熟的spexin由14個氨基酸組成[3]，在脊椎動物中高度保守，并且廣泛表達于中樞神經系統、消化道上皮及內分泌細胞中[4].研究證實，spexin屬于甘丙肽(galanin)家族，可有效激活甘丙肽受體2(GALR2)和甘丙肽受體3(GALR3)[5].組織分布結果顯示，GALR 2/3廣泛表達于中樞神經系統和外周組織中，表明spexin可能具有多種生物學功能.

總的來說，spexin通過擔當體循環中的內分泌信號和中樞神經系統中的神經遞質的方式來發揮它的生物學功能[6].現已研究報道的功能主要有以下幾方面：①促進胃腸道運動[1, 7]；②抑制動物的攝食[7-12]；③影響脂類代謝、血糖水平和能量平衡[13-19]；④鎮痛作用[5-20]；⑤對內分泌組織的影響[3, 21-22]；⑥心血管和腎臟功能[20-23]；⑦抗抑郁和焦慮[24-25].盡管目前對spexin的研究不斷增多，也發現了其越來越多的功能，但這只是個開始，從現有的成果來看，它與物質代謝、機體內分泌和神經中樞都有著千絲萬縷的聯系，值得我們進一步深入去探索它更多的功能，并闡明其中機制，最終服務于各種疾病的治療.為此，課題組構建了spexin轉基因模型小鼠，并成功實現了穩定繁育.這將為探索spexin更多的功能和相關機制提供更好的動物模型.同時開展了以spexin轉基因小鼠為對象的糖耐受實驗，以對該模型小鼠進行初步的表型分析，同時尋求它在葡萄糖代謝方面更多的證據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Tris 、EDTA購自美倫生物技術有限公司；DNA Marker購自Thermo Scientific公司；Taq DNA Polymerase 試劑盒購自Takara Biomedical Technology公司；Proteinase K購自Merk公司；瓊脂糖(Biowest)購自上海貝晶生物技術有限公司；核酸染料GelRed購自Biotium公司.PCR引物由上海生物工程有限公司合成；spexin ELISA試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals；葡萄糖購自Sigma；高脂飼料購自美國Research Diets；普通飼料和玉米芯墊料均購自四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所.

1.2 儀器

Biosens SC Series-805全自動凝膠成像系統(中國上海)；Eppendrof 5424R低溫高速離心機(德國)；Analytik Jena FlexCycler 2多功能PCR儀(德國)；IKA干浴器(德國)；一恒THZ-100B恒溫培養搖床(中國上海)；君意JY-SPCT型水平電泳槽(中國北京)；血糖儀(美國強生)；iMark 酶標儀(日本Bio-Rad).

1.3 轉基因小鼠的構建

Spexin轉基因小鼠由賽業(廣州)生物科技有限公司轉基因動物中心構建，背景為C57BL/6.構建過程為：將利用piggyBac(PB)轉座子構建的spexin過表達載體pPB[Exp]-CAG>mB230216G23Rik[NM_001242345.1], 用顯微注射技術注射到小鼠受精卵內，再轉移到代孕母鼠內自然生產，最后通過PCR法鑒定篩選子代陽性轉基因小鼠.

1.4 小鼠的飼養和繁殖

小鼠飼養于SPF級動物房，溫度控制在21～23 ℃，濕度 50%～65% ，光照控制12 h明/12 h暗，所喂飼飼料、水及所用墊料、籠盒均經過嚴格高壓滅菌，小鼠可自由采食和飲水，除在哺乳期的母鼠，每一籠內小鼠不超過4只，墊料每周更換一次.小鼠繁殖時將同代性成熟的雌鼠和雄鼠按2∶1配對，并保證雌雄鼠基因型互異，每天觀察小鼠的狀態并及時添補食水，母鼠懷孕后立即單獨放入新的籠盒待產.出生小鼠3周后斷奶并與母鼠分開喂養，用不銹鋼耳釘進行編號，并剪尾鑒定基因型.

1.5 小鼠的基因型鑒定

1.5.1 小鼠尾部組織基因組DNA的提取

在子鼠3周齡與母鼠分籠后，剪取2～3 mm尾部組織，置于1.5 mL Eppendorf管中，加入100 μL 消化緩沖液(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris - HCl，0.1% Triton X - 100)和1 μL 蛋白酶K(終質量濃度0.5 mg/mL)，56 ℃，190 r/min搖床過夜.然后98 ℃金屬浴13 min使蛋白酶K變性.最后室溫下14 000 r/min離心15 min，取1.5 μL上清液做PCR.

1.5.2 小鼠基因型的聚合酶鏈反應(PCR)

用G蛋白調節子7(Rgs7)做內參，用了2對靶向spexin的引物來驗證.所用引物序列見表1.反應體系為25 μL，ddH2O 8.6 μL, 正反向的目的基因引物各0.8 μL，內參各0.4 μL，預混聚合酶12.5 μL，模版1.5 μL.PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，35個循環；72 ℃ 延伸5 min；-20 ℃ 保存.

表1 PCR引物

注：Rgs7(G蛋白調節子7)為內參.

1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖0.128 g 溶于16 mL 1×TBE中，微波加熱充分溶解后加入1.6 μL Gelred混勻，降溫至50～60 ℃，倒入插好梳子的膠床，冷卻30 min以上即可使用.DNA每孔加5 μL，電泳電壓120 V，時間35 min.電泳結束后用凝膠成像儀進行拍攝和分析.

1.6 小鼠血清spexin檢測

取小鼠全血80～100 μL，室溫靜置1～2 h，4 ℃，3 500 r/min 離心10 min，取上清50 μL，按Phoenix Pharmaceuticals spexin ELISA試劑盒方案測定其中所含spexin的濃度.

1.7 糖耐受實驗

隨機選取了10～14周齡的轉基因型雄鼠、野生型雄鼠各8只，于實驗前85 d飼喂高脂飼料，每天稱量小鼠體重，進行糖耐受實驗時平均體重達42 g.小鼠出生日期及連續飼喂高脂飼料85 d后的體重信息如表2所示.從第86天開始，開始糖耐受實驗，為減少組間差異，選體重相近的陰陽小鼠各一只組成一組，2只小鼠于實驗前一天同時禁食16 h，每天上午一組下午一組共4只進行糖耐受實驗，16只小鼠分4 d完成實驗.給藥方式采用灌胃按1 g/kg的劑量給葡萄糖，分別在0、15、30、60、90、120 min時從尾靜脈取血測定血糖濃度[26].

表2 糖耐受實驗小鼠信息

1.8 數據統計

實驗數據以Mean±SEM的形式表示，用Graphpad prism 7軟件進行Student’s t - test顯著性差異分析.p值小于 0.05 作為有顯著性差異，p值小于 0.01 作為有極顯著性差異.

2 結果

2.1 小鼠的基因型鑒定

所用引物共有3對，內標引物擴增出的條帶為507 bp，靶向小鼠內源性Rgs7基因，故野生型和轉基因型小鼠均在507 bp的位置有明亮的條帶.目標基因由兩對引物共同確證，野生型小鼠在301 bp(圖1b)、300 bp(圖1a)的位置均沒有條帶；而spexin轉基因型的小鼠在301 bp(圖1b)、300 bp的位置均能擴增出很亮的條帶(圖1a).說明轉基因型小鼠體內spexin過表達的PB轉座子成功插入小鼠基因組中，且能穩定遺傳.

子鼠出生3周后剪尾提取總DNA后進行PCR擴增，之后進行瓊脂糖凝膠電泳.PCR擴增時總共使用3對引物，圖1a是采用表1中spexin F2、spexin R2及內參Rgs7 F 、Rgs7 R兩對引物，靶向spexin的引物可擴增出分子量為300 bp的片段，內參擴增出的片段分子量為507 bp.電泳結果為轉基因型小鼠分別在300 bp和507 bp位置有很亮的條帶，野生型僅507 bp的位置有很亮的條帶；圖1b是采用表1中spexin F1、spexin R1及內參Rgs7 F 、Rgs7 R兩對引物，靶向spexin的引物可擴增出分子量為301 bp的片段.電泳結果為僅轉基因型小鼠可在301 bp的位置出現很亮的條帶.所用DNA ladder分子量為100～1000 bp.

2.2 ELISA試劑盒測定血清中spexin濃度結果

我們隨機測定了轉基因型雌鼠、野生型雌鼠、轉基因型雄鼠、野生型雄鼠各10只血清中spexin的含量，結果如圖2所示，雌性轉基因型小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.25倍，兩者之間具有極顯著性差異(P=0.009 4)，雄性轉基因型小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.23倍，兩者之間也具有極顯著性差異(P=0.009 6)；而無論是野生型雌雄小鼠之間(P=0.5366)還是轉基因型雌雄小鼠之間(P=0.682 2)，它們血清中spexin的濃度均無顯著性差異.說明轉基因型小鼠體內轉入的基因能穩定高表達，spexin轉基因小鼠構建成功且其血清中的含量沒有性別差異.

隨機抽取40只小鼠測定血清中spexin的濃度，圖2a是雌性轉基因型小鼠和野生型小鼠血清中spexin濃度具有極顯著性差異(轉基因型為野生型的1.25倍，P=0.009 4)；圖2b是雄性轉基因型小鼠和野生型小鼠血清中spexin濃度具有極顯著性差異(轉基因型為野生型的1.23倍，P=0.009 6)；圖2c是野生型小鼠雌性和雄性小鼠之間血清中spexin濃度沒有差異(P=0.536 6)；圖2d是轉基因型小鼠雌性和雄性小鼠之間血清中spexin濃度沒有差異(P=0.6822).結果表示為Mean±SEM(n=10/組)，Student’s t - test結果為**P< 0.01，ns(not significant，差異無統計學意義)P>0.05.

2.3 糖耐受實驗初步驗證轉基因小鼠表型

飼喂高脂飼料的85 d內，每天稱量小鼠體重，小鼠平均體重由25.02 g增長至42.58 g，但是轉基因型小鼠和野生型小鼠之間體重增長無差異(圖3a)；糖耐受結果顯示，轉基因型小鼠每個時間點的血糖濃度均低于野生型小鼠的，且在15 min時，兩者具有顯著性差異(P=0.018 2)(圖3b).說明在spexin轉基因小鼠模型體內，spexin表達水平的升高在一定程度上提高了小鼠的糖耐受能力，但對脂代謝的影響不夠顯著.

隨機挑選10 ～ 14周齡的小鼠，轉基因型和野生型各8只，于糖耐受實驗前85 d開始飼喂高脂飼料，每天監測體重變化.圖3a是飼喂高脂飼料85 d后，小鼠平均體重由25.02 g達到42.58 g，但轉基因型小鼠和野生型小鼠的體重變化沒有顯著性差異；圖3b是給小鼠禁食16 h后，采用灌胃的方式給小鼠1 g/kg的葡萄糖，分別在0、15、30、60、90、120 min時從尾靜脈取血測定血糖值.結果在每個時間點，轉基因型小鼠的血糖濃度均低于野生型小鼠的，且在15 min時，兩者具有顯著性差異(P=0.0182).結果表示為Mean ± SEM(n=8/組)，Student’s t - test結果為*P<0.05.

3 討論

Spexin作為一個新發現的神經肽，在脊椎動物中高度保守且分布廣泛，意味著它可能具有多種生物學功能.從現有的研究成果看，它在胃腸道運動、動物攝食、脂類代謝、糖類代謝、鎮痛、內分泌組織、心血管和腎臟、抑郁和焦慮等方面都有一定的功能，但其相關機制和信號傳導通路等尚待探索.且無論從spexin的組織分布還是從目前窺探到的功能來看，這個新型的神經肽都值得更深入的研究，未來它或可為肥胖、糖尿病、抑郁、焦慮等尚困擾著我們人類的疾病的治療提供新的思路和策略.

鑒于以上所述，課題組成功構建了spexin轉基因小鼠，并成功實現了穩定繁育.這將為開展更多關于spexin的研究提供很好的模式動物.我們構建的轉基因小鼠，從PCR結果上看，spexin過表達的PB轉座子已成功插入基因組，而從ELISA結果上看，該片段能穩定表達出spexin.也就是說，無論從基因層面還是蛋白層面，我們構建的轉基因小鼠都是成功的.而且通過對小鼠的繁育及生長狀態的監測，該spexin轉基因小鼠的基因型可穩定遺傳，其外觀表型與野生型小鼠并無明顯差異.

目前已有不少研究發現spexin跟脂類和葡萄糖的代謝相關，有研究報道，在人體內血液循環中spexin含量與代謝綜合征有關[27].隨機挑選了16只雄鼠(轉基因型和野生型各8只)于實驗前85 d飼喂高脂飼料，每天監測體重變化，當平均體重達42.58 g時進行了糖耐受實驗.結果發現轉基因型小鼠每個時間點的血糖濃度均低于野生型小鼠，且在15 min時具有顯著性差異.這從一定程度上反映出在小鼠體內，spexin與葡萄糖的代謝有關聯.此前已有研究報道，給高脂飼料誘導的肥胖小鼠注射spexin能改善小鼠糖耐受能力[17].實驗結果為此結論提供了更多的佐證.此外，亦有研究報道在II型糖尿病病人血液中spexin的水平相對健康人顯著降低，且與血液中葡萄糖的含量呈負相關[16].通過臨床研究發現，成年健康女性血液中spexin的水平與血糖顯著負相關[15].但也有研究表明，spexin的水平在一定程度上影響了處于孕期中女性的血糖水平[28]，且與患有妊娠期糖尿病女性的血糖正相關[29].這些研究結果說明spexin與葡萄糖代謝具有相關性，但其具體功能及機制仍需進行深入研究.在飼喂高脂飼料85天內，轉基因型小鼠和野生型小鼠的體重變化并沒有顯著性差異.之前有報道給野生型小鼠連續腹腔注射spexin 28 d，劑量為25 μg/kg時，能顯著抑制小鼠體重增長，測定血清中spexin濃度發現，該組小鼠血清中spexin濃度為對照組的1.86倍[19].而根據ELISA結果，構建的轉基因模型雄性小鼠血清中spexin濃度為野生型小鼠的1.23倍.此外還有小鼠的個體差異、所飼喂飼料差異、樣本容量大小，把這些因素綜合起來可能是轉基因型小鼠和野生型小鼠之間體重增長沒有顯著性差異的原因.

綜上所述，構建的spexin轉基因小鼠模型，在基因層面和蛋白層面spexin的含量都較野生型有顯著提高，且其糖耐受能力也有所增強.該模型的成功構建，將為今后做關于spexin更系統、更深入的研究提供很好的模式動物.