2種外源鈣對鎘脅迫三七生理生化特性及其鎘積累的影響

李 娜， 李 濤， 梅馨月， 阮明菊， 吳艷瓊， 祖艷群

(云南農業大學 資源與環境學院， 云南 昆明 650201)

隨著礦產資源大量開發利用，各種化學產品、農藥、地膜、化肥的廣泛使用以及城市污泥、污水在農業上的利用，重金屬對土壤水體的污染也越來越嚴重[1]。鎘是常見的重金屬污染物，不能被微生物降解，并且在土壤中滯留時間長；鎘的生物遷移性很強，可在植物根、莖、葉及籽粒中大量積累[2-7]。鈣不僅是三七生長發育必需的一種營養元素，也是三七體內重要的調節因子，其不僅能夠維持細胞壁、細胞膜及膜結合蛋白的穩定性，還可作為第二信使參與植物體內多種代謝活動，在反應中也會作為關鍵離子起到酶促作用[8-10]。施用外源鈣可有效減少植物體內鎘的含量。有研究表明，施用外源鈣能夠緩解鎘對水稻籽粒造成的傷害[11]。目前有關外源鈣處理與鎘脅迫相互作用的報道多集中在農作物和重金屬修復植物上，主要涉及外源鈣處理對植物鎘吸收的影響及對鎘脅迫下植物葉綠素含量的影響等方面，而外源鈣處理對鎘脅迫下植物其他生理代謝的影響報道較少[12-13]。

三七(Panaxnotoginseng) 又名血參、田七等，為五加科人參屬多年生草本植物。干燥塊根入藥，具有止血、活血、散瘀、定痛、滋補、降壓、降脂、降血糖、免疫調節等功效[14]。據報道，云南省文山州富含鋅、銅、鉛等(非)金屬礦，土壤重金屬背景值相對較高[15-18]。近年來，隨著采礦區域的無序擴張以及含金屬農藥的大量使用，三七種植區土壤重金屬污染問題日益嚴重，對三七藥品安全產生嚴重威脅，三七重金屬含量超標已有許多報道[19]。由于三七為喜陰性宿根性植物，種植 3年后具有較好的藥用價值。 在種植期間，極易遭受各種病蟲的危害，嚴重影響三七的品質和產量。為保證三七的產量，在種植過程中不得不使用化學農藥，造成三七產品中偶有農藥和三七重金屬含量超標的現象[20]。為保證三七用藥安全，筆者等通過盆栽方法，探討施用氯化鈣和石灰對鎘脅迫2年生三七生物量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量及三七不同部位對鎘累積的影響，以期為三七種植業的健康持續發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

三七，1年生籽苗(文山丘北道地材料)，CdCl2·2.5H2O(上海金山亭新化工試劑廠)，石灰(丘北石灰廠)，氯化鈣(原天津市化學試劑三廠)。

土壤背景值為pH 6.18，有機質含量30.46 g/kg，全氮0.36 g/kg，全磷13.69 g/kg，全鉀10.48 g/kg，堿解氮19.25 mg/kg，速效磷181.83 mg/kg，速效鉀188.19 mg/kg，鎘含量0.30 mg/kg，鈣含量40.85 g/kg。

1.2 試驗設計

試驗在云南農業大學大河橋現代農業教育科研基地(海拔1 870 m，N25°31′1″，E103°16′48″)進行。采取盆栽試驗方法，每盆裝土17 kg。試驗共設置4個Cd2+濃度梯度，分別為0 mg/kg、0.6 mg/kg、6.0 mg/kg和12 mg/kg ，采用CdCl2·2.5H2O配制。氯化鈣和石灰設置3個Ca2+濃度梯度，分別為0 mg/kg、180.2 mg/kg和360.4 mg/kg。各個濃度梯度的Cd2+與氯化鈣和石灰交互處理，共24個處理。其中，鎘、氯化鈣和石灰濃度均為0 mg/kg的處理為對照，各處理與盆栽土壤混合均勻，每個處理5次重復。土壤平衡2 周后，每盆土中移栽1年生三七籽苗6株。移栽后，盆口覆蓋3 cm云南松松針，以保持盆內水分，按常規栽培管理進行。

1.3 考察指標的測定

1.3.1 株高 在三七成熟期，采用量尺對三七地上莖基部分至復葉柄基部的長度(不含花軸)進行測定。

1.3.2 生物量的測定 于三七成熟期，將采集到的七植株主根、剪口、須根及莖葉在105℃下殺青0.5 h，隨即在80℃下烘干至恒重，用分析天平稱重。

1.3.3 植物鎘含量的測定 在成熟期收獲全株植物，分為不同部位后，準確稱取0.2 g植物樣品于三角瓶中，放入數粒玻璃珠，加入10 mL混合酸，(HNO3∶HClO4為4∶1)，加蓋浸泡過夜，在三角瓶口加一小漏斗后于電爐上進行消解，若變為棕黑色再加混合酸，直至冒白煙，消化液呈無色透明或略帶黃色，放冷用滴管將試樣消化液濾入10 mL容量瓶中并定容至刻度,混勻備用，同時做試劑空白。用火焰原子吸收分光光度計測定鎘含量[21]。

1.3.4 SOD、POD、CAT活性和MDA含量測定 在三七旺盛生長期采集主根樣品，放入凍存管，液氮速凍，速凍后移入-80℃冰箱保存，待測。準確稱取植物樣品0.5 g于研缽中，加入pH 7.8的磷酸緩沖溶液5 mL，冰浴條件下盡快研磨至勻漿，然后以4 000 r/min于4℃離心10 min，取上清液用于試劑盒測定，采用酶標儀〔北京普朗新技術有限公司，DNM-9602，產品注冊號:京藥監械(準)字2013 第2400147 號〕測定OD值，計算CAT、POD、SOD活性和MDA含量[22]。

1.4 數據分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 2種外源鈣對鎘脅迫三七株高的影響

從圖1可知，未施用鈣時，不同濃度鎘脅迫下，三七株高呈先增后降趨勢，各處理間差異不顯著。在不同濃度鎘脅迫下，施用氯化鈣處理均可促進三七株高的生長，且不同濃度氯化鈣處理的三七株高均顯著高于未施用氯化鈣處理。其中，在不同濃度鎘脅迫下，施用氯化鈣180.2 mg/g處理的株高較未施用氯化鈣的處理增加0.25%～0.5%，360.4 mg/kg氯化鈣處理的株高較未施用氯化鈣的處理增加3%～45.6%。不同濃度鎘脅迫下，施用石灰能夠增加三七的株高，在0.6 mg/kg鎘脅迫下，施用180.2 mg/kg石灰處理與360.4 mg/kg和未施用石灰處理差異顯著，180.2 mg/kg石灰處理的三七株高較未施用石灰的株高增加32.7%。在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg鎘脅迫下，施用360.4 mg/kg石灰處理與180.2 mg/kg石灰處理和未施用石灰處理差異顯著。在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg鎘脅迫下，施用360.4 mg/kg石灰處理的株高分別較未施用石灰處理增加25.0%和37.6%。

注：圖中不同小寫字母表示相同濃度鎘脅迫下不同濃度鈣處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同濃度鈣處理下不同濃度鎘脅迫間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant difference among different calcium treatments under cadmium stress of the same concentrations (P<0.05); Different capital letters indicate significant differences among cadmium stress at different concentrations with the same treatment of calcium(P<0.05). The same below.

圖1施用氯化鈣和石灰鎘脅迫三七的株高

Fig.1 HeightP.notoginsengby Cd stress plus calcium chloride and lime application

2.2 2種外源鈣對鎘脅迫 2年生三七成熟期生物量的影響

從圖2可知，不同濃度鎘脅迫下，施用不同濃度氯化鈣和石灰處理三七主根生物量、剪口生物量、須根生物量及莖葉生物量的變化。

2.2.1 主根生物量 未施用外源鈣，不同濃度鎘脅迫下，三七主根生物量呈先增后降趨勢，各處理間差異不顯著。在不同濃度鎘脅迫下，施用氯化鈣可促進三七主根生物量的積累。在0.6 mg/kg 鎘脅迫下，施用180.2 mg/g氯化鈣處理和360.4 mg/g氯化鈣處理顯著高于未施用氯化鈣處理，分別較未施用氯化鈣處理增加16%和33%。在其余濃度鎘脅迫下，氯化鈣不同濃度處理的主根生物量均與未施用氯化鈣處理間差異不顯著。在不同濃度鎘脅迫下，施用不同濃度石灰處理的三七主根生物量均與未施用石灰處理的三七主根生物量無顯著差異。

2.2.2 剪口生物量 未施用外源鈣，不同濃度鎘脅迫下，三七剪口生物量均顯著高于無鎘脅迫處理。在0.6 mg/kg和6.0 mg/kg鎘脅迫下，不同濃度氯化鈣處理的三七剪口生物量均與未施用氯化鈣處理無顯著差異。在12.0 mg/kg鎘脅迫下，施用180.2 mg/kg氯化鈣處理的三七剪口生物量顯著高于未施用氯化鈣處理。在不同濃度鎘脅迫下，施用石灰處理大多數可促進三七剪口生物量的積累，但均與未施用石灰處理無顯著差異。

2.2.3 須根生物量 未施用外源鈣，不同濃度鎘脅迫下，三七須根生物量呈先降后升趨勢，各處理間差異不顯著。在0.6 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫下，不同濃度氯化鈣處理三七須根生物量均較未施用氯化鈣處理高，各處理間差異不顯著。在6.0 mg/kg鎘脅迫下，360.4 mg/kg氯化鈣處理顯著高于180.2 mg/kg氯化鈣處理和未施用氯化鈣處理，較未施用氯化鈣處理高66%。不同濃度鎘脅迫下，施用石灰處理均可促進三七須根生物量的積累，各處理間差異不顯著。

圖2 施用氯化鈣和石灰鎘脅迫三七各部位的生物量

2.2.4 莖葉生物量 未施用外源鈣，不同濃度鎘脅迫下，三七莖葉生物量呈先升后降趨勢，各處理間差異不顯著。在0.6 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫下，施用氯化鈣處理多數可促進三七莖葉生物量的積累。在6 mg/kg鎘脅迫下，360.4 mg/kg氯化鈣處理的莖葉生物量顯著高于未施用氯化鈣處理和180.2 mg/kg氯化鈣處理，較未施用氯化鈣處理高38%。不同濃度鎘脅迫下，施用石灰多數可促進三七莖葉生物量的積累，各處理間差異均不顯著。

2.3 2種外源鈣對鎘脅迫三七 MAD含量及 SOD、POD和CAT活性的影響

從表1可知，不同濃度鎘脅迫下，施用不同濃度氯化鈣和石灰對三七植株MAD含量、SOD、POD和CAT活性的影響。

2.3.1 MDA含量 未施用外源鈣不同濃度鎘脅迫下，三七植株MDA含量呈先降后升趨勢。在鎘濃度為12 mg/kg時，MDA含量最高，為1 738.56 pmol/g。施用外源鈣后，三七植株MDA含量均較未施用外源鈣的高(無鎘脅迫，添加氯化鈣處理6 mg/kg鎘脅迫180.0 mg/kg石灰處理及12 mg/kg鎘脅迫，添加石灰處理的除外) 。其中，在6 mg/kg鎘脅迫處理下，施用360.4 mg/kg氯化鈣的三七植株MDA含量最高，為1 926.67 pmol/g，較未施用氯化鈣的高16%。在12 mg/kg鎘脅迫處理下，施用180.2 mg/kg石灰處理的三七植株MDA含量最低，為1 332.71 pmol/g，較未施用石灰處理降低23%。

2.3.2 SOD活性 未施用外源鈣不同濃度鎘脅迫下，三七植株的SOD活性呈先升后降趨勢。其中0.6 mg/kg鎘脅迫處理顯著高于無鎘脅迫處理。0.6 mg/kg鎘脅迫下三七的SOD活性較無鎘脅迫處理顯著增加12.4%。無鎘脅迫處理與其余鎘脅迫處理間無顯著差異。不同濃度鎘脅迫下，施用不同濃度氯化鈣和石灰均使三七植株中的SOD活性下降，其中，在0.6 mg/kg鎘脅迫下施用360.4 mg/kg氯化鈣時，三七植株SOD活性最低，較未施用氯化鈣處理的降低16.7%，在0.6 mg/kg鎘脅迫下施加360.4 mg/kg石灰時，三七植株SOD活性最低，較未施用石灰處理的降低18.2%。

表1施用氯化鈣和石灰鎘脅迫三七莖葉 MDA含量及抗氧化酶活性

Table 1 MDA content and antioxidant enzyme activities ofP.notoginsengleaves treated with calcium chloride and lime by cadmium stress

處理 Treatment鈣制劑Cd濃度/(mg/kg)Ca濃度/(mg/kg)MDA/(pmol/g)SOD/(U/g)POD/(U/g)CAT/(ng/g)氯化鈣 001 597.56±45.24 aAB260.16±17.40 aB0.99±0.07 aA139.89±0.97 aBC Calcium 180.21 558.79±278.16 aA237.20±7.72 abA0.92±0.08 aA146.71±26.89 aA chloride360.41 457.17±149.86 aB233.73±8.54 bA0.94±0.04 aA119.94±20.12 aB 0.601 494.69±133.76 bB292.45±8.63 aA0.97±0.06 aA145.01±1.06 aB 180.21 814.08±10.01 aA259.03±1.4 bA0.95±0.08 aA129.88±18.53 aA360.41 512.83±122.26 bAB243.50±17.48 bA0.92±0.04 aA146.00±16.91 aAB 601 667.24±104.57 aAB288.47±13.32 aAB0.97±0.07 aA161.88±10.19 aA180.21 829.07±339.51 aA255.26±7.95 aA0.93±0.02 aA131.49±13.30 bA 360.41 926.67±380.33 aA252.70±28.66 aA0.89±0.09 aA131.21±18.73 bB 1201 738.56±149.43 aA266.45±17.21 aAB0.81±0.05 bB131.97±5.16 bC 180.21 854.15±255.02 aA261.59±22.36 aA0.88±0.09 abA135.74±2.18 bA 360.41 789.54±69.02 aAB249.46±10.37 aA0.98±0.07 aA174.58±3.97 aA石灰 Lime 001 597.56±45.24 bAB260.16±17.40 bB0.99±0.07 aA139.89±0.97 bBC 180.21 754.20±66.25 abB267.69±12.67 bA0.94±0.04 aA127.82±4.73 cBC 360.41 849.54±130.41 aA300.94±6.88 aA0.96±0.05 aAB167.53±8.20 aA 0.601 494.69±133.76 bB292.45±8.63 aA0.97±0.07 aA145.01±1.06 abB180.22 030.12±121.08 aA274.61±14.6 aA0.82±0.11 aAB153.18±3.12 aA 360.41 810.96±134.73 aA239.19±13.28 bC0.82±0.07 aB137.76±8.03 bB 601 667.24±104.57 aAB288.47±13.32 aAB0.97±0.07 aA161.88±10.19 aA 180.21 566.43±57.38 aC259.54±6.41 bA0.65±0.05 bC116.96±6.38 cC 360.41 687.16±46.28 aAB251.08±9.82 bC1.05±0.05 aA139.93±6.42 bB 1201 738.56±149.43 aA266.45±17.21 aAB0.81±0.05 aB131.97±5.16 aC 180.21 332.71±63.85 bD260.44±7.69 aA0.75±0.04 aBC137.51±8.36 aB 360.41 589.74±56.71 aB272.69±11.57 aB0.59±0.10 bC109.14±8.00 bC

注：同列不同小寫字母表示相同濃度鎘脅迫下不同濃度鈣處理間差異顯著(P<0.05，n=5)，不同大寫字母表示相同濃度鈣處理下不同濃度鎘脅迫間差異顯著(P<0.05，n=5)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate that there is significant difference between different concentrations of calcium treatment under the same concentration of cadmium stress (P<0.05, n=5). Different capital letters indicate significant differences between different concentrations of cadmium stress under the same concentration of calcium (P<0.05, n=5). The same below.

2.3.3 POD活性 未施用外源鈣不同濃度鎘脅迫下，三七植株的POD活性呈下降趨勢，無鎘脅迫處理0.6 mg/kg、6 mg/kg鎘脅迫處理與12 mg/kg鎘脅迫處理差異顯著，無鎘脅迫處理0.6 mg/kg和6 mg/kg鎘脅迫處理間差異不顯著。與無鎘脅迫處理鎘脅迫處理相比，12.0 mg/kg鎘脅迫下三七植株的POD活性著降低18.2%。在不同濃度鎘脅迫下，施用氯化鈣和石灰處理多數使三七植株的POD活性下降。

2.3.4 CAT活性 未施用外源鈣不同濃度鎘脅迫下，三七植株的CAT活性呈先升后降趨勢，其中無鎘脅迫處理和0.60 mg/kg鎘脅迫處理與6.0 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫處理差異顯著，無鎘脅迫處理與0.60 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫處理差異不顯著。與無鎘脅迫處理相比，6.0 mg/kg鎘脅迫下三七的CAT活性顯著增加15.7%。6.0 mg/kg鎘脅迫下，與未施用氯化鈣相比，施用180.2 mg/kg、360.4 mg/kg氯化鈣的三七CAT活性分別顯著降低18.8%和18.9%。6.0 mg/kg鎘脅迫下，與未施用石灰相比，施用180.2 mg/kg石灰的三七CAT活性顯著降低28%。12.0 mg/kg鎘脅迫下，施用360.4 mg/kg石灰的三七CAT活性較未施用石灰顯著降低17.3%。

2.4 2種外源鈣對鎘脅迫三七鎘含量的影響

由表2可知，三七不同部位鎘含量依次是須根>莖葉>剪口>主根。未施用外源鈣不同濃度鎘脅迫下，三七主根、剪口、莖葉及須根中的鎘含量均呈上升趨勢，與無鎘脅迫處理相比，6 mg/kg鎘脅迫下三七的主根和須根的鎘含量分別顯著增加255%和96.7%，12 mg/kg鎘脅迫下，三七的主根和須根的鎘含量分別顯著增加400%和161%。0.6 mg/kg、6 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫下三七剪口和莖葉的鎘含量顯著上升。未施用氯化鈣處理條件下，與無鎘脅迫處理相比，6 mg/kg和12 mg/kg鎘脅迫下三七主根、須根、剪口和莖葉的鎘含量顯著上升。無鎘脅迫處理下，與未施用氯化鈣相比，施用180.2 mg/kg氯化鈣三七剪口和須根中鎘含量分別降低15.8%和7.9%，施用360.4 mg/kg氯化鈣三七剪口和須根中鎘含量分別降低18.0%和16.4%。無鎘脅迫下，與未施用石灰相比，施用360.4 mg/kg石灰三七剪口、莖葉中鎘含量分別降低21.1%和16.0%。在6.0 mg/kg鎘脅迫下，施用180.2 mg/kg和360.4 mg/kg氯化鈣三七不同部位中鎘含量較未施用氯化鈣分別降低13.3%～20.7%和17.5%～22.8%；施用180.2 mg/kg和360.4 mg/kg石灰三七不同部位中鎘含量與未施用石灰相比分別降低16.7%～21.1%和25.8%～33.3%。12.0 mg/kg鎘脅迫下，施用360.4 mg/kg氯化鈣與不加氯化鈣相比，三七各部位中鎘含量分別顯著降低16.5%～27.5%。參照《地理標志產品文山三七》GB/T 19086-2008，鎘的限量標準為0.5 mg/kg，分析比較三七各部位中的鎘含量發現，在6.0 mg/kg和12.0 mg/kg鎘脅迫下，三七主根和剪口中鎘均嚴重超標；在0.6 mg/kg、6.0 mg/kg和12.0 mg/kg鎘脅迫下，三七莖葉和須根中的鎘含量大部分嚴重超標。

表2施用氯化鈣和石灰鎘脅迫三七不同部位鎘的含量

Table 2 Contents of cadmium in different parts of P. notoginseng treated with calcium chloride and lime by cadmium stress

3 結論與討論

研究結果表明，低濃度鎘脅迫可促進三七植株株高的生長及生物量的積累，但高濃度鎘脅迫，三七植株株高的生長及生物量的積累受到抑制。在不同濃度鎘脅迫下，三七植株的MDA含量和抗氧化酶活性呈不同變化。隨著鎘脅迫濃度的升高，三七植株各部位的鎘含量升高。在不同濃度鎘脅迫下，施用氯化鈣和石灰處理可促進三七植株株高的生長及生物量的積累，提高三七植株的MDA含量，降低三七植株的抗氧化酶活性和三七植株各部位的鎘含量。其中，在6.0 mg/kg鎘脅迫下，施用360.4 mg/kg氯化鈣三七不同部位中鎘含量較未施用氯化鈣降低17.5%～22.8%，施用360.4 mg/kg石灰三七不同部位中鎘含量較未施用石灰相比降低25.8%～33.3%，從對三七的降鎘效應看，石灰處理優于氯化鈣處理。

鈣作為植物必需的營養元素之一，參與植物的多種生命活動與酶的代謝過程，生理學研究發現，外施鈣可以增強植物對許多非生物逆境的適應性，減輕逆境對植物所造成的傷害[23-24]。研究表明，在鎘脅迫處理濃度相同時，施用氯化鈣和石灰能提高三七的株高和生物量，與李賀等[25]在大蒜的研究結果類似。6.0 mg/kg鎘脅迫下，施用氯化鈣180.2 mg/kg和360.4 mg/kg與不加氯化鈣相比三七不同部位中鎘含量分別降低13.3%～20.7%和17.5%～22.8%。因此，施用適當的外源鈣能夠有效降低植株各部位鎘含量，與肖厚軍等[26]在白菜的研究結果類似。緩解毒害作用的原因可能是Ca與膜磷脂的極性頭部結合，通過交聯作用，使膜脂分子和蛋白質分子結合緊密，從而降低了膜的透性減輕了鎘的生理毒害。施用石灰后能降低三七對鎘的吸收，石灰施用量增加能緩解一定的鎘毒害作用。相同氯化鈣和石灰處理下，0.6 mg/kg鎘脅迫處理的三七株高較未經鎘處理的高，表明低Cd脅迫能顯著增加三七幼苗株高和生物量，與吳桂容等[27]研究一致。在鎘脅迫下，施用氯化鈣和石灰時，三七植株MDA含量反而上升，可能是由于氯化鈣和石灰反而促進了鎘對植物的毒害作用，氯化鈣和石灰濃度越高，促進作用越明顯，但對于抗氧化酶來說，在鎘脅迫下，隨著氯化鈣和石灰濃度上升，抗氧化酶活性降低，越有利于植物生長。

結果表明，無鎘脅迫處理和0.6 mg/kg鎘脅迫處理時，施用高濃度的石灰使三七的MDA含量升高。李賀的研究發現，高濃度的鈣對大蒜有不利的影響，使得 CAT 和 POD 等防御酶活性降低[28]。龔小敏[29]探究外源鈣對鎘脅迫下作物的影響中也發現相似的規律。在鎘脅迫條件下，2種含鈣物質同濃度下對三七細胞抗氧化酶和三七植株鎘含量的積累響應各異，同一鎘脅迫下，施用相同鈣濃度的石灰和氯化鈣，石灰處理后三七植株的鎘含量低于氯化鈣處理。