陳文詩,宋 娜,張雨晴,楊雪嬌,朱 瑋,楊 先
青光眼作為第一大不可逆性致盲性眼病,是以特征性視神經萎縮和視野缺損為共同特征的疾病[1]。2010年全球青光眼患者約6000萬人,預計2020年將達到8000萬人,2040年全球將有1億多青光眼患者,而中國2010年青光眼患者約有1600多萬人,預計2020年將超過2000萬人[2-3]。在各種類型的青光眼中最常見的是開角型青光眼[3]。高眼壓是青光眼最主要的致病機制,導致眼壓升高的主要原因是房水傳統流出途徑中小梁網(trabecular meshwork,TM)的病理學改變所致房水外流阻力增加[4]。研究表明TM細胞是房水傳統流出途徑的主要細胞,有調節眼壓平衡的重要作用,通過這一途徑房水正常流出幾乎沒有任何阻力,但是如果TM細胞發生功能障礙,這一無阻力的房水流出途徑便產生了額外的“阻力”,導致房水外流阻力增加,這就是大部分青光眼眼壓升高的原因[5]。
目前臨床中延緩青光眼進展的最主要方式就是控制眼壓,研究表明眼壓降低20%~40%可使視野損失的進展延緩一半[6]。青光眼治療首選降眼壓藥物,其次為激光和手術治療[1]。目前最常用的降眼壓藥物包括擬交感神經藥、β-腎上腺能阻滯劑、腎上腺能受體激動劑、前列腺素衍生物、碳酸酐酶抑制劑、高滲劑等,分別通過增加房水流出、抑制房水生成、減少眼內容積等途徑降低眼壓來治療青光眼[7]。但是這些降眼壓藥物都沒有作用于青光眼最根本的致病部位——TM細胞。此外,部分患者無法用藥物控制眼壓則需激光或手術治療,然而通過這些有創的方式仍有部分青光眼患者病情進行性加重,最終導致失明。鑒于青光眼致盲的不可逆性、患病人群的龐大及目前治療方式的局限性,尋找新的青光眼治療方式迫在眉睫。
近期研究發現Rho激酶抑制劑(Rho-associated protein kinase inhibitor, ROCKi)主要通過改變TM細胞形態、細胞運動、胞質分裂和平滑肌收縮等影響細胞骨架,從而增加房水流出,降低眼壓。ROCKi作為直接作用于TM細胞的降低眼壓的新型藥物,在青光眼原發病變部位進行治療,已于2014年在日本被批準進入臨床使用[8-10]。由于ROCKi具有增加血管灌注、促進視神經再生等作用,可能對視神經也有保護作用,此外,還具有減少濾過泡瘢痕化等作用[11]。綜上,ROCKi作為新型降眼壓藥物有相當的應用前景。本文將針對Rho/Rho激酶信號通路、ROCKi的作用機制及其臨床應用展開綜述。
1.1 Rho/Rho激酶信號通路Rho蛋白是由Rho基因編碼的信號肽,由200~300個氨基酸組成,相對分子質量為20~30kDa。在細胞信號傳導中,Rho蛋白起著開關作用,當Rho蛋白與GDP結合,使Rho蛋白激活。Rho激酶(Rho-associated protein kinase inhibitor, ROCK)為Ras超家族之一的Rho亞組,是一組分子量約為160kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,而激活的Rho蛋白與ROCK結合使之活化,活化的ROCK可使下游的細胞內底物磷酸化。最具代表性的底物包括肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)、肌球蛋白磷酸酶底物1(myosin phosphatase substrate 1, MYPT1)、LIM激酶、CP1-17、鈣調蛋白(calmodulin, CaM)和ERM蛋白質。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)可以直接使MLC磷酸化,調節平滑肌的收縮,而激活的ROCK是MLCK活化的關鍵調控途徑,并且近期研究表明RCOK可以獨立調節Ca2+的血管平滑肌收縮和細胞與細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的相互作用,來調節房水的外排[12]。同樣,ROCK的激活可以使MYPT1磷酸化,抑制激動蛋白的收縮[13]。正是由于ROCK通過與這些底物相互作用,調節肌球/動蛋白收縮、細胞粘附、細胞僵硬度、細胞形態和ECM合成,從而調控房水的流出,維持眼壓平衡[14]。
1.2 Rho/Rho激酶信號通路在青光眼發病機制中的作用Rho激酶的兩種同工型ROCK1(ROKb/P160)和ROCK2(ROKa),具有近65%的同源性,并且由位于人體上的兩種不同基因編碼,分別位于18號和2號染色體。眼部組織中除晶狀體外都同時有ROCK1和ROCK2的表達,以往研究表明ROCK1和ROCK2基因敲除的小鼠出現眼壓降低的現象,進一步證實ROCK的缺失對眼壓有降低作用[15]。在青光眼患者的房水中發現,轉化生長因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等細胞因子的高表達,而TGF-β能夠顯著增加交聯肌動蛋白網絡(cross-linked actin networks, CLANs)的形成,誘導ECM蛋白質的合成,并且可以促進CTGF的產出,使細胞粘附性增加,增加細胞硬度,增加房水流出阻力[16]。LPA可以誘導多種類型的細胞反應,包括ROCK調節的細胞粘附、收縮、細胞增殖、細胞遷移、細胞因子和趨化因子分泌、血小板聚集、平滑肌細胞轉化和神經突回縮,可以影響TM細胞的收縮和粘附特性,并被認為參與青光眼的發病機制[17]。此外,通過比較正常眼與青光眼TM細胞骨架發現,青光眼的F-actin蛋白位于更中心的位置,并且呈無序的形態,細胞骨架的改變是青光眼的一大重要致病機制[18]。青光眼患者通過促進Rho/Rho激酶信號通路傳導途徑,使下游MYPT1、MLC、LIMK等細胞因子增多,肌球/動蛋白平衡改變,增加ECM蛋白質的合成,改變了細胞骨架,使細胞粘附性增加,最終導致房水流出減少,眼壓升高[11]?;赗OCK在肌動蛋白管理的重要作用,所以ROCKi作為促進TM細胞房水流出的降眼壓藥物,也是直接作用于青光眼病變原發部位的藥物而備受矚目[19]。
2.1不同ROCKi的降眼壓作用機制目前研究發現不同種類的ROCKi,包括Y-27632、Y-39983、HA-1077、H-1152、K-115等均有改變TM細胞收縮的作用,一定程度增加房水流出,降低眼壓。但是其作用濃度、降眼壓的幅度、作用機制有一定的差異,如Y-39983局部給藥降眼壓作用比Y-27632明顯,HA-1077對ROCK的特異性較Y-27632弱[20-22]。其中Y-27632為最近發現的一種Rho激酶抑制,也是最常用于研究改善房水流出功能機制的ROCKi,對ROCK1和ROCK2的選擇性抑制幾乎沒有差異[14, 23]。其在不同物種有一定的降低眼壓作用,下文將以Y-27632作為ROCKi代表詳細講述其降眼壓的機制。
在體外實驗中,通過Y-27632處理的人TM細胞在顯微鏡下觀察出現了細胞收縮、變圓的形態學變化,并且在免疫熒光顯微鏡下觀察到通過Y-27632處理的細胞大部分肌動蛋白束消失、粘著斑的減少等細胞骨架的改變,并且明顯抑制了TGF-β誘導CLANs的形成, 定量PCR發現Y-27632處理過的細胞明顯比地塞米松處理過的細胞纖維連接蛋白、ECM蛋白的表達低,Western免疫印記可以看出經過Y-27632使細胞纖維連接蛋白,膠原蛋白1A和波形蛋白的表達顯著降低,并且Y-27632可以誘導肌球蛋白輕鏈的去磷酸化,而MLC磷酸化狀態是Rho//Rho激酶信號通路調節細胞和松弛的重要因素[16, 24-25]。凝血酶增加細胞硬度高達200%,而同時加入Y-27632可使細胞硬度減低到40%~80%;凝血酶可使細胞電阻增加到160%,而Y-27632將細胞電阻降低至60%左右,并導致細胞與細胞的分離[26]。這些都表明Y-27632通過對細胞骨架和ECM的影響,從而改善房水流出功能,起到降眼壓作用。另外,以往研究表明一氧化氮(nitric oxide,NO)對TM細胞有放松作用,增加房水流出量,并且青光病患者眼中NO和NOS的表達水平降低,ROCKi對eNOS mRNA和NO產生的促進作用,這也可能與其降眼壓作用有關[27]。除了目前較常使用的ROCKi,最近又新發現了一種新型ROCKi—SB772077B,在和Y-27632相同濃度處理細胞顯示出更明顯的細胞收縮,肌蛋白束和黏著斑的減少。這種新型ROCKi對ROCK1的選擇性比ROCK2更高[28]。
2.2 Y-27632在不同物種中的降眼壓作用1997年首次通過局部給藥、前房注射、玻璃體注射Y-27632分別測量兔眼的眼壓和房水流暢系數、瞳孔直徑,結果發現Y-27632有明顯增加房水流出、增大瞳孔直徑和降眼壓的圖1Rho激酶抑制劑在青光眼治療中的作用模式圖。
作用[29]。之后Y-27632作為最常用的ROCKi在不同物種實驗中被廣泛用于ROCKi的降眼壓機制研究。在體內實驗中,Y-27632在小鼠、兔、豬、猴、人身上都有顯著增加房水流出,降低眼壓的作用[15]。在豬眼、猴眼和人眼灌注模型中,灌注不同壓力的Y-27632都呈現出近管小梁組織(juxtacanalicular TM,JCT)增厚,與房水流暢系數顯著增大的結果成正相關[23]。但是由于灌注系統的不同,達到顯著差異的時間和灌注量不同種類也不相同,無法進行種群的比較[24, 30-31]。但是可以明顯看出Y-27632有改善房水外流的作用(圖1)。
3.1 ROCKi的降眼壓應用基于以上體內外實驗的研究,一些醫藥公司開始探索ROCKi在人體中降眼壓的影響,相繼研發新藥物,在評估人體臨床安全性和有效性后,目前研發出的藥物包括Ripasudil(K-115)、Fasudil(HA-1077)、SNJ-1656、AMA0076、AR-12286和Netarsudil(AR-13324)等,其中Fasudil為雖然被批準運用于臨床,但是還未用于青光眼的治療[32], Ripasudil(Kowa)和Netarsudil(Aerie),分別在日本和美國成功進入Ⅲ期臨床試驗階段。在Ⅲ期臨床試驗中,每日兩次局部給予0.4% ripasudil平均減少青光眼患者晝夜眼壓2.9mmHg。Ripasudil最近在日本獲得批準用于治療高眼壓和青光眼,并且這種藥物與β受體阻滯劑噻嗎洛爾聯用時可以增強療效,這也預示作為與其他降眼壓藥物有不同降眼壓機制的ROCKi可與其他類型降眼壓藥物聯用,增大降眼壓的效果。在Ripasudil Ⅲ期臨床試驗中發現,輕度結膜充血為最常見的不良反應,發生率高達75%。此外,結膜炎、點狀角膜炎等也有發生[8, 14]。Netarsudil為ROCK/去甲腎上腺素轉運蛋白(norepinephrine transporter, NET)抑制劑化合物,除了作為RCCK抑制劑的作用外,還有抑制去甲腎上腺素的作用,具有持續降眼壓的作用,并且局部耐受性好,僅有輕度的結膜充血反應[33]。針對現有ROCKi藥物的不良反應,目前改進的手段包括使用ROCK2特異性抑制藥物KD025和短效的溫和型ROCKi。不過目前看來,經過3a的臨床應用,目前還沒有發生較嚴重的不良事件[34]。因此,ROCKi這一直接作用于TM細胞的可以顯著降眼壓的新型藥物是值得期待的。
3.2 ROCKi的其他眼部效應有研究表明,ROCKi除了作用于TM細胞而降低眼壓外,對眼部其他部位的作用也可能有額外的效果,如延緩青光眼的進展、降低青光眼術后濾過道瘢痕化等。青光眼性視神經損傷的機制之一是血管缺血,導致視神經供血不足。最近,在小鼠動物模型中發現Ripasudil可以減輕視網膜水腫、減少缺血灌注區、改善視網膜靜脈的灌注[10]。因此,ROCKi對于減緩青光眼的進展,不僅是由于降低眼壓,還可能通過改善視神經缺血而發揮作用。此外,有研究報道稱ROCKi對小鼠的視神經具有保護作用,可促進視神經軸突的再生,但在人體上是否也有同樣的效果仍需進一步試驗,如果在人身上有同樣作用,那么ROCKi不僅在TM細胞上有著降眼壓的作用,并且對于視神經也可能具有保護作用。另外,目前青光眼濾過手術失敗的主要原因就是濾過泡和ECM沉積物瘢痕化,成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞是傷口愈合和瘢痕形成的關鍵步驟,與ECM蛋白、生長因子和整合素的表達增強有關,最近研究表明ROCKi可通過抑制成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞來減少瘢痕,主要是通過抑制TGF-β信號傳導和LPA誘導的纖維化反應減少膠原蛋白基質收縮和ECM沉積[11](圖1)。
綜合前期的基礎研究、臨床試驗及近3a的臨床應用,ROCKi作為直接作用于TM細胞的新型降眼壓藥物的效果是值得肯定的。如果今后進一步研究發現ROCKi在人體上也有增加血液灌注,促進視神經再生的作用,那么ROCKi對于青光眼患者治療中的應用價值可能會進一步提升。但是,目前對于ROCKi的認識還不夠充分,其降眼壓的機制尚未有完全的認識,需要進一步的研究。