霍亂弧菌檢測技術的研究進展

王國臻 王玉格 王憲鈺 馬麗 王彬 李天園

【摘 要】霍亂是由霍亂弧菌所引起的烈性腸道傳染病，其傳播速度極快，發病急，屬于國際檢疫傳染病，其被我國列為甲類傳染病?；魜y的快速檢測顯得極其重要，現在國內外有很多檢測霍亂弧菌的方法。主要是傳統的檢測方法及分子生物學和免疫學的方法，本文主要對近幾年最新的霍亂弧菌檢測技術的研究進展進行綜述。

【關鍵詞】霍亂弧菌；檢測技術；分子生物學；免疫學

霍亂是一種烈性腸道傳染病，霍亂的病原體—霍亂弧菌（Vibrio cholerae）經人工培養呈桿狀或彎曲弧狀，有鞭毛能運動的革蘭陰性菌?；魜y弧菌由于O抗原的不同，被分為155個血清群，主要是O1群和O139群可導致霍亂的發生，其他血清型尚未發現可致霍亂，O1群和O139群主要引起感染者劇烈嘔吐，腹瀉，失水，肌肉痙攣甚至死亡。所以霍亂弧菌的快速檢測顯得極其重要。國內外學者建立了大量應用廣泛的檢測技術。其中傳統的細菌培養，生化檢測以及血清學檢測等作為常規的檢測方法被應用。近來，分子生物學，免疫學和倆者結合的技術越來越成熟，以其快速簡便，準確性高，特異性極強等優點被廣泛應用。

1.霍亂弧菌的致病機理及流行情況

產生霍亂毒素的霍亂弧菌為產毒株，其主要致病毒素是霍亂腸毒素，霍亂弧菌的致病物質與其染色體上的多個基因有關，主要致病因子有三個，a.CTX基因原件，b.TCP致病性島，c.ToxR，霍亂腸毒素是由A亞單位和B亞單位構成的一個多聚體蛋白，當人或動物感染后，B亞單位可與攻擊對象的小腸黏膜上皮細胞上的受體結合，然后A亞單位進入細胞，導致一系列酶反應發生，然后引起腸道分泌功能亢進，引起大量液體及血漿中的大量電解質進入腸腔，由于分泌功能超過腸道的重吸收能力，從而導致人體嚴重的腹瀉，由于脫水和電解質缺失，引起循環衰竭，血壓下降繼而腦供血不足，然后缺氧昏迷；更甚者不發生嘔吐和腹瀉癥狀，直接進入中毒性休克而死亡。

2.檢測方法

2.1傳統的檢測方法

霍亂弧菌兼性厭氧，營養要求簡單，在堿性蛋白胨水或平板上生長良好，所形成的菌落無色透明，扁平或稍凸起，邊緣整齊?，F國內已有許多選擇培養基，如TCBS等。其生化反應氧化酶陽性，過氧化物酶陽性，吲哚反應陽性。能發酵多種單糖，雙糖，產酸產氣，發酵乳糖遲緩，不分解阿拉伯糖、水楊素等?；魜y弧菌在無鹽的生存環境中也可生活，其他菌則不能。

2.2分子生物學方法

2.2.1 PCR-激光誘導熒光-毛細血管電泳檢測方法

此方法以毛細血管電泳法和激光誘導熒光檢測器結合用以檢測霍亂弧菌，此方法首先讓霍亂弧菌腸毒素CTXA基因來選擇引物，然后利用PCR法擴增霍亂弧菌的特異性基因片段，所得到的PCR產物，然后利用高效毛細管電泳-激光誘導熒光快速檢測，此方法對毛細血管電泳法和PCR條件進行了改良，用以實現快速檢測。在改良的PCR條件下，霍亂弧菌的CTXA基因有效擴增，無特異性條帶；擴增產物測序發現其與基因庫的序列同源性比匹配度幾乎達到100%，其檢測結果與普通凝膠電泳法一致。此方法優點明顯，所需的檢驗樣品少，非?？焖?，所建立的技術先進，可應用于科研等專業實驗室。

2.2.2環介導恒溫擴增技術

環介導恒溫擴增技術是一項非常特殊的技術，它可以針對基因的多個區域然后設計不同的特異性引物，然后在鏈置換DNA聚合酶的作用下，進行恒溫擴增，15到60min左右即可實現十的九次方倍的核酸擴增，目前已有人開展相關研究，這種方法應用于霍亂弧菌的檢測時，是利用霍亂弧菌外膜蛋白的ompW基因設計特異性引物，建立霍亂弧菌的環介導恒溫擴增技術檢測方法，同時對霍亂弧菌進行擴增，然后檢測其靈敏度和特異性，此技術與普通PCR法進行比較，反應速度極快， 而且反應結果都可以通過肉眼直接觀察斷定，實驗顯示此檢測辦法靈敏度極高，特異度為100%?？捎糜谑称贩矫娴臋z測，與傳統的檢測方法比大大縮短了檢測的時間，靈敏度高，其可直接用于霍亂弧菌的現場流行學檢查。

2.3免疫學方法

2.3.1近紅外免疫層析法

近紅外免疫層析法的建立用以快速檢測O1群霍亂弧菌，其借鑒近紅外熒光探針的定量免疫層析試紙條，其建立的技術基礎為低噪聲激發式熒光標記的O1群霍亂弧菌免疫層析試紙條，利用了近紅外免疫層析技術，雙抗體夾心法檢測O1群霍亂弧菌，然后制造靶向O1群霍亂弧菌的免疫層析的試紙條，此方法順應了使用更高靈敏度的標記物替代膠體金顆粒的發展趨勢，其檢測結果快速準確，特異性強，此方法與普通膠體金方法相比較，其靈敏度提高了100倍，極大的提高檢驗檢疫效率。

2.3.2膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法可對霍亂弧菌O1群和O139群進行快速檢測，膠體金免疫層析法運用膠體金免疫層析技術，以雙抗體夾心法檢測霍亂弧菌O1群和O139群，然后對此方法進行其靈敏度，特異性等方面的對比，與細菌培養法檢測多份臨床標本相比較該方法能在十分鐘內完成檢測，此方法具有操作簡便快速，靈敏度高，不需任何儀器設備、能夠同時檢測大量樣品等優點?？捎糜谶M出口的檢測。

3.結語

綜上所述，分子生物學和免疫學方法對霍亂弧菌的檢測都有著良好的靈敏度和特異性，能達到快速檢測的目的。分子生物學方面，隨著引物與探針的設計更精確，其檢測技術也越來越成熟，因成本低，效率高等優點被廣泛應用；免疫學方面，因操作簡單，工作量大，檢測快速等優點也被廣泛推廣。我們應該將其與分子生物學與免疫學相結合，然后再確定病原體，相信不久的將來，人們可以發現更多的方式檢測霍亂弧菌，為霍亂弧菌的早期檢測和臨床治療提供更多的有價值的信息。

【參考文獻】

[1]肖東樓.霍亂防治手冊（6版）[M].北京：人民衛生出版社，2013：5.

[2]Kaper J B， Morris J G Jr， Levine M M .Cholera .Clin MicrobiolRev， 1995， 8 （1）：48- 86.

[3]王玉金，楊書豪，劉麗，等.霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測法的建立[J].中國人獸共患病學報，2012，28（11）：1126-1129.

[4]龔震，楊小平. 全球2012年霍亂流行與防制概況[J].疾病監測，2013，28（12）：1035-1038.

[5]李美霞，魏躍紅，楊智聰，等.2005—2010 年廣州市霍亂流行特征及監測結果分析[J].熱帶醫學雜志，2011，11（10）：1184-1185.

[6]Fykse E M，Nilsen T，Nielsen A D，et al. Real-time PCR and NASBAfor rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae in ballast water[J]. Mar Pollut Bull，2012，64： 200-206.

[7] Preeprem S，Mittraparp-arthorn P，Bhoopong P，et al.Isolation and characterization of Vibrio cholera isolates from seafood in Hat Yai city，Songkhla，Thailand[J]. FoodbornePathogDis， 2014，11；881-886.

[8] Rajpara N， Vinothkumar K， Mohanty P， et al. Synergistic effect ofvarious virulence factors leading to high toxicity of environmental V.cholerae non-O1 / non-O139 isolates lacking ctx gene ： comparative study with clinical strains[J]. PLoS One， 2013， 8： 1-10.

[9] Waldor M K， Mekalanos J J. ToxR regulates virulence gene expres-sion in non -O1 strains of Vibrio choleraethat cause epidemic cholera[J]. Infect Immun， 1994， 62： 72-78.