丹參提取物及益心舒片中丹酚酸B 在大鼠體內的藥物代謝動力學研究

劉云峰，李海島，李 正，蔡 芳，徐飛鵬

益心舒片收載于《中國藥典》2015 版，由人參、麥冬、黃芪、五味子、丹參、川芎及山楂提取制成，具有益氣復脈、活血化瘀、養陰生津之功效[1]。臨床主要用于氣陰兩虛、瘀血阻脈所致的胸痹，證見胸痛胸悶、心悸氣短、脈結代，冠心病心絞痛見上述證候者。其中丹參是處方中主藥之一，丹酚酸B 是丹參中的主要藥效成分，也是益心舒片中的主要藥效成分之一。丹酚酸B 具有抗動脈粥樣硬化、抗不穩定心絞痛、抑制肝纖維化、保護腎臟、抗腫瘤及防治糖尿病并發癥等藥理作用[2-6]。關于丹參提取物和中藥復方中丹酚酸B 的藥動學研究已分別有報道[7-15]，而國內還沒有關于丹參提取物及其復方制劑中丹酚酸B 的藥動學差異比較的相關報道。為考察益心舒片中丹酚酸B 在體內過程是否受中藥配伍的影響，本次研究對大鼠分別灌胃丹參提取物和益心舒片，通過藥動學研究來闡明傳統中藥復方配伍具有一定的合理性和科學性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級SD 雄性大鼠（江蘇大學動物實驗中心提供），體重250～300 g。Waters e2695 型高效液相色譜儀（PDA 檢測器）；高速冷凍離心機（Sigma公司）；BP211D 電子天平（Sartorius 公司）；微量移液器（Thermo 公司）；RE501 旋轉蒸發儀（西安遠艦儀器廠）；HH 恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）；渦旋震蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；冷凍干燥機（賽飛公司）。甲醇（HPLC，honeywell 公司）；乙腈（HPLC，默克公司）；丹參提取物【自制，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測得丹酚酸B 含量為12.984 mg/g】；丹酚酸B 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201514）；益心舒片（貴州信邦制藥股份有限公司，國藥準字Z20090491，批號：180703，RP-HPLC 法測定丹酚酸B 含量為2.839 mg/g；注射用水（江蘇吉貝爾藥業股份有限公司自制）；其余試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：286 nm；流動相：甲醇-乙腈-0.5%甲酸水溶液（27 ∶7 ∶66）；流速：1.0 ml/min；柱溫30 ℃。

1.2.2 配制對照品溶液 取丹酚酸B 對照品適量，精密稱定，加甲醇稀釋制成每1 ml 含0.1012 mg 的溶液，即得。

1.2.3 丹參提取物的制備 稱取丹參藥材適量，加85%的乙醇加熱回流提取2次，第一次3 h，第二次1.5 h，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度約為1.12～1.15 的清膏，經冷凍干燥后，備測。經HPLC 法測得丹酚酸B 的含量為12.984 mg/g。

1.2.4 血漿預處理 采用微量移液器吸取血漿100 μl，加0.2 ml 甲醇，渦流振蕩2 min，13 000 r/min 高速離心7 min，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。

1.2.5 藥動學研究 隨機將12 只SD 雄性大鼠平均分成2 組，給藥前禁食12 h，可以自由飲水，實驗前將丹參提取物和益心舒片（去薄膜衣后）分別用1%羧甲基纖維素鈉分散，灌胃給藥，給藥劑量按丹酚酸B折算均為60 mg/kg，并于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 眼 眶 后靜脈叢取血，置EP 管中，按“1.2.4”項處理后測定。

1.2.6 藥物動力學參數及統計學處理 根據所獲得的血漿中丹酚酸B 的峰濃度Cmax及達峰時間Tmax，藥動學參數均由Excel 2010 軟件處理，計量數據以表示，其他藥動學參數采用DAS 2.0 軟件進行擬合處理，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 專屬性 分別取空白血漿、加入丹酚酸B 對照品的空白血漿、灌胃丹參提取物的血漿樣品及灌胃益心舒片的血漿樣品，按“1.2.4”項處理，分別進針，色譜圖見圖1。由圖可見，分離效果好，專屬性強。

2.2 線性范圍、檢測限 精密吸取“1.2.2”項下丹酚酸B 對照品溶液適量置1 ml 離心管中，加入100 μl 大鼠空白血漿，按“1.2.4”項處理對照品溶液，配制成丹酚酸B 濃度分別為0.253、0.506、1.012、2.530、5.060、10.120 μg/ml 的血漿樣品，進樣分析，以測得的峰面積（Y）對血藥濃度（X）進行線性回歸，標準曲線為Y=74.752X+1537（r2=0.9996）（n=6），血漿中丹酚酸B 在0.253～10.120 μg/ml 之間呈良好線性關系，丹酚酸B 檢測限為0.063 μg/ml。

2.3 加樣回收試驗 精密吸取空白血漿100 μl 置于1 ml 離心管中，計18 份，分成三組，每組6 份，精密加入丹酚酸B對照品適量，按“1.2.4”項下方法操作，分別配制成1.012、2.530、5.060 μg/ml的3種濃度樣品，分別測定丹酚酸B 含量，并計算加樣回收率，結果見表1。

2.4 精密度試驗 取丹酚酸B 濃度為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的3 種不同濃度的血漿樣品，分別日內、日間各測定5次，計算日內、日間的精密度，結果見表2。

表1 丹酚酸B 加樣回收試驗（n=6，）

表1 丹酚酸B 加樣回收試驗（n=6，）

加入量/μg·ml-1 測得量/μg·ml-1 回收率/% 相對標準偏差/% 1.012 0.979±0.024 96.74 2.45 2.530 2.467±0.039 97.51 1.58 5.060 4.963±0.081 98.08 1.63

表2 丹酚酸B 精密度試驗（n=6）

表2 丹酚酸B 精密度試驗（n=6）

加入量/ μg?ml-1日內 日間測得量/μg·ml-1相對標準差/%測得量/μg·ml-1相對標準偏差/% 1.012 0.982±0.025 2.55 0.977±0.028 2.87 2.530 2.483±0.042 1.69 2.474±0.044 1.78 5.060 4.974±0.087 1.75 4.953±0.089 1.80

圖1 丹酚酸B 在大鼠血漿樣品中的HPLC 色譜圖

2.5 提取回收率 取上述的丹酚酸B 濃度為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的血漿樣品（n=6），按“1.2.4”項下方法處理，進入色譜儀測定，得到丹酚酸B 平均峰面積A1；另取空白血漿100 μl，先不加對照品溶液，其他操作按“1.2.4”操作，得到上清液之后，向上清液中加入適量的丹酚酸B 對照品溶液，使丹酚酸B 濃度也分別為1.012、2.530、5.060 μg/ml 的樣品，分別進入色譜儀，得到丹酚酸B 平均峰面積A2，計算3 個不同濃度的血漿樣品中丹酚酸B 的提取回收率（R=A1/A2×100%）。3 個不同濃度的提取回收率分別達到84.7%、87.9%和88.5%，其相對標準差分別為3.3%、2.6%和2.7%。

2.6 穩定性實驗 取含有丹酚酸B 濃度為2.530 μg/ml的大鼠血漿樣本分別經室溫即時測定、室溫放置24 h后測定、冷藏室內（4℃）放置3 d 后測定、反復凍融3 次測定，以及零下20℃冷凍儲藏1 月測定，結果表明丹酚酸B 血漿樣品在各條件下均有良好穩定性。

2.7 藥動學參數 本次實驗對得到的血藥濃度-時間的數據用DAS 2.0藥動學軟件進行擬合計算，其平均藥-時曲線見圖2，主要的藥動學參數見表3，結果表明，丹參提取物和益心舒片中的丹酚酸B 在大鼠體內的藥代過程非常類似，且益心舒片藥動學參數更優。

3 討 論

圖2 丹酚酸B 在大鼠體內的藥-時曲線

表3 丹酚酸B 在大鼠體內的主要藥動學參數（n=6，）

表3 丹酚酸B 在大鼠體內的主要藥動學參數（n=6，）

注：與丹參提取物組比，①P＜0.05

參數 益心舒片 丹參提取物 t1/2β（h） 0.182±0.133 0.194±0.176 t1/2Ka（h） 0.426±0.051① 0.612±0.056 AUC0 →t（μg·h·ml-1) 3.225±0.286① 1.775±0.403 AUC0 →∞（μg·h·ml-1) 3.397±0.293① 1.982±0.475 Tmax（h） 1 1 C max （μg·ml-1） 2.587±0.229① 1.723±0.172

在本研究中，方法具有良好的專屬性，空白血漿無干擾，丹酚酸B 與其他內源性成分分離效果良好，且在此色譜條件下，血漿中丹酚酸B 的理論塔板數不低于2 500；血漿中丹酚酸B 在0.253～10.120 μg/ml 之間線性關系良好，血漿中丹酚酸B 檢測限為0.063 μg/ml，能很好地通過檢測要求；在實驗中，分別于日內和日間各測定5 次3 種不同濃度的血漿樣品，日內及日間精密度均符合要求；本方法具有良好的提取回收率，滿足實驗要求；穩定性實驗表明，丹酚酸B 血漿樣本在各條件下均有良好穩定性。

實驗前期，分別采用固相萃取法及有機溶劑蛋白質沉淀法作為丹酚酸B 血漿樣品的預處理方法。多次比較后發現固相萃取法提取丹酚酸B，回收率較低，且與有機溶劑蛋白質沉淀法相比，操作比較繁瑣，所以優先選擇有機溶劑蛋白質沉淀法。筆者還分別采用不同有機溶劑來處理血漿樣品，發現采用甲醇來沉淀血漿效果比較理想，且流動相中本身含有甲醇，對檢測影響較小。在甲醇用量方面，發現甲醇用量的加大，血漿雜質峰數量并沒有明顯減少，反而會影響丹酚酸B血漿樣品的測定，經過多次試驗，最終將血漿-甲醇的體積比確定為1 ∶2。本實驗中采用甲醇沉淀蛋白提取丹酚酸B 的樣品前處理，操作簡單、便捷、高效，符合藥動學研究的要求。實驗初期，采用2015 版中華人民共和國藥典一部所載的益心舒片中丹酚酸B 的測定方法，用于本次藥動學研究中血漿樣品的丹酚酸B檢測，但通過前期的摸索研究，筆者嘗試微調了流動相中有機相比例，丹酚酸B 與周圍的其他成分能很好地分離。筆者分別對兩組大鼠進行灌胃給予丹參提取物和益心舒片后，丹酚酸B 的藥動學研究顯示，灌胃益心舒片后，益心舒片中的中藥配伍能明顯影響丹酚酸B 在大鼠的體內過程，具有明顯提高丹酚酸B 的生物利用度效果。

整體觀是中醫理論的基礎，中藥復方是中醫用藥的傳統精髓。由于中藥在臨床上辨證用藥均以復方為主，單味中藥的藥動學研究難以代表復方的藥動學特征。研究復方的藥動學特征，應以復方本身為研究對象，并考慮復方中的中藥配伍等關系，才能得到較為準確的數據。本研究表明，丹參提取物和益心舒片中丹酚酸B 的藥動學特征存在著較大差異，益心舒片中的其他配伍中藥成分可明顯增加丹酚酸B 在大鼠體內的吸收，表明了中藥配伍給藥在臨床上確實有一定的合理性，配伍給藥能夠明顯改善某些有效成分的體內吸收。在研究中，筆者也意識到復方制劑中僅以其中所含的個別成分的藥代動力學結果來斷定復方制劑的整體藥代動力學特征，還缺乏相應的科學依據，這也是今后需要在中藥復方制劑藥代動力學研究中重點考慮的問題。