小胸鱉甲胞外銅鋅超氧化物歧化酶重組蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

孜拉吉古麗·西克然木， 馬紀， 庫爾班·吐松， 劉小寧

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊830046)

昆蟲的分布、生長與其生存環境緊密相關。對許多生物體來說，溫度是最重要的環境因素，它通過誘導許多生理反應來影響生物生長繁殖、分布和豐度(Parmesan，2006；Angillettaetal.，2010；Jiaetal.，2011)。任何環境溫度的變化均會引起昆蟲體內一系列的生理響應，包括低溫脅迫(史亮等，2013)。當昆蟲處于低溫脅迫時，細胞內的酶促反應速率下降，呼吸鏈某些點的三磷酸腺苷(ATP)需求和電子積累減少，這種情況促使一些活性氧(ROS)突然增加，引起機體內ROS的積累而導致氧化應激(Chattopadhyay，2002)。超氧陰離子自由基(O2·-)通常是第一個產生的ROS。O2·-的產生可能引發更多反應性ROS(OH-、ONO2-、HOO·)的形成，這些反應性ROS可能對生物大分子，包括膜脂、蛋白質、核酸和其他細胞成分造成潛在的破壞(Gill & Tuteja，2010)?；哪ハx經常遭受惡劣環境的影響，如寒冷的氣候(S?mme，1995)。因此昆蟲在適應環境的自我保護調節中，為抵御自由基的傷害，形成了一整套高效的抗氧化系統，以清除和解毒累積的氧自由基(馮從經等，2002；Hermeslima & Zentenosavín，2002；杜堯，2007)。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體中的主要抗氧化酶家族，被認為是抗氧化防御系統的第一道防線，通過將超氧化物轉化為H2O2和水來抵抗氧化應激(Ackerman & Brinkley，1966；Mccord & Fridovich，1988)。SOD的獨特之處在于其活性決定了2種Haber-Weiss反應底物O2和H2O2的濃度，因此它是防御機制的核心(Gill & Tuteja，2010)。在真核生物中，SOD有3種清楚的亞型：一種是定位于細胞質中的Cu/Zn-SOD，即SOD1，一種是定位于細胞外的EC-SOD，即SOD3，還有一種以Mn為輔助因子的SOD，即Mn-SOD，也被稱為SOD2(Zelkoetal.，2002)。

小胸鱉甲Micorderapunctipennis隸屬于鞘翅目Coleoptera擬步甲科Tenebrionidae，為生活在中國西北部新疆古爾班通古特沙漠的一種特有種，該地區1月土壤表面和土壤下5 cm的平均溫度分別為-12 ℃和5 ℃，因此其成蟲具有很強的耐寒性，且存在冷馴化機制(黃人鑫等，2005)。小胸鱉甲在低溫冷馴化過程中可能會受到自由基的傷害，從而導致氧化應激。課題組前期對小胸鱉甲低溫轉錄組數據進行GO分析，結果表明SOD是相應低溫脅迫反應的8個顯著上調的基因之一(庫爾班·吐松等，2016)。因此，抗氧化應激是小胸鱉甲對冷應激反應的一個重要方面。本研究將小胸鱉甲胞外Cu/Zn-SOD基因與pET-32a表達載體連接，在大腸桿菌Escherichiacoli中誘導表達出目的蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，重組蛋白分子量約為42 kDa。利用Ni2+親和純化獲得了這種重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，并對純化的重組蛋白的酶學性質進行了分析。同時制備了該重組蛋白的多克隆抗體。本研究結果為進一步研究ecCu/Zn-SOD的功能及其在昆蟲中的耐寒性機制提供了有效的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

小胸鱉甲收集于新疆維吾爾自治區阜康市222團(87°51′E，44°24′N)的準噶爾盆地古爾班通古特沙漠南緣地帶。將樣品帶回實驗室并在30 ℃±0.5 ℃、16 h∶8 h(光照∶黑暗)光周期、相對濕度為30%±6%條件下用麥麩和新鮮卷心菜葉飼養。黃粉蟲Tenebriomolitor在飼養室進行人工飼養。KM小鼠購于新疆醫科大學動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK(新)2018-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003]。蛋白質相對分子質量Marker和BCA蛋白濃度定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。小鼠抗His-tag抗體(TA-02，IgG1)、辣根過氧化物(HRP)酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體[ZB-2305，IgG(H+L)]和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。四甲基聯苯胺(TMB)溶液購于Life Technologies；Ni2+親和層析系統為Novagene產品；ELISA板購自廣州潔特生物過濾制品有限公司，其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的誘導表達與純化前期構建并鑒定正確的pET32a-MpecCu/Zn-SOD重組質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)，保存于30%甘油中。挑取重組子于含有氨芐的LB液體培養基中，37 ℃ 220 r·min-1震蕩過夜培養。次日以1∶100轉接于新鮮LB(含氨芐)液體培養基中培養，至OD600為0.5時，加入終濃度為0.3 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，22 ℃ 100 r·min-16 h。同時設pET32a(+)空載體菌為誘導對照。取1 mL上述誘導的大腸桿菌經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，超聲裂解，12 000 r·min-15 min。分別收獲上清和沉淀，等量上樣，觀察上清液和細胞沉淀的含量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮藍R250染色2 h后脫色過夜，檢測重組蛋白的可溶性表達。

將含有重組質粒pET32a-MpecCu/Zn-SOD的BL21(DE3)菌株接種于含有氨芐(50 μg·mL-1)的LB液體培養基中，37 ℃ 220 r·min-1震蕩培養至OD600=0.5時加入終濃度為0.3 mmol·L-1的IPTG于22 ℃ 100 r·min-16 h，12 000 r·min-110 min，收集菌體，以PBS洗滌2次并重懸沉淀，超聲破碎菌體，12 000 r·min-110 min，收集沉淀。在8 mol·L-1尿素中4 ℃過夜變性。次日，將總蛋白吸附到5 mmol·L-1咪唑(pH8.0)平衡柱子上3 h，然后分別用20 mmol·L-1咪唑(pH8.0)洗3次后，再用50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1、120 mmol·L-1、200 mmol·L-1咪唑(pH8.0)通過His-Trap親和柱進行洗脫純化。含6 mol·L-1尿素的PBS 4 ℃透析過夜。接著分別用含4.0 mol·L-1、3.0 mol·L-1、2.0 mol·L-1、1.0 mol·L-1、0 mol·L-1梯度濃度的尿素1×PBS透析各4 h，12 000 r·min-15 min，上清即為可溶性的復性蛋白。用聚乙二醇超濾濃縮，小管分裝，-80 ℃保存。SDS-PAGE檢測蛋白質純化情況并確定最佳洗脫濃度。然后用BCA蛋白濃度定量試劑盒進行定量。

將20 μL純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD進行12%SDS-PAGE后，在50 mA下電泳轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%脫脂奶粉在4 ℃下封閉過夜。次日將封閉的膜在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中洗滌3次，每次5 min，并以小鼠抗His IgG1(1∶1 000稀釋)作為一抗，以帶辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(稀釋度為1∶5 000)作為二抗，于DAB中顯色并拍照。

1.2.2 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的部分酶學性質分析采用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD濃度，重復取樣測定3次，最后根據所得標準曲線計算目的蛋白濃度。參照SOD試劑盒(測分型)說明書(南京建成生物科技有限公司)，采用黃嘌呤氧化酶法測定純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的酶活性。

取純化好的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，檢測溫度、pH對該蛋白酶活性的影響，為減少誤差，每個實驗設置3個平行組，并重復測定3次。溫度處理組中，取等體積純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD溶液于試管中，分別置于15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中，保溫20 min，再用酶標儀分別測定各組的吸光值，計算酶活性。在pH處理組中，將等體積SOD純化酶液分別加入pH5、6、7、8、9、10、11、12的緩沖液體系中，室溫孵育30 min后測定酶活性。緩沖體系的配置分別為0.2 mol·L-1Citrate Buffer(pH2、3、4、5和6)，0.2 mol·L-1Tris-HCl Buffer(pH7、8和9)以及0.2 mol·L-1Glycine/NaOH Buffer(pH10、11、12)。

1.2.3 多克隆抗體的制備及特異性分析免疫前，用眼眶采血法收集5只小鼠血液，每只300 μL，37 ℃ 30 min，4 ℃ 1 h，3 500 r·min-110 min，上層血清-80 ℃保存，作為陰性對照。純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD作為抗原免疫小鼠：每只小鼠用50 μg重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，足墊和皮下注射；14 d后，50 μg重組蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化，足墊和皮下注射免疫；之后每隔15～20 d加強免疫1次，共2次。免疫后分別收集血清，-80 ℃保存。

純化的重組蛋白經包被液稀釋，抗原終濃度為5 μg·mL-1，96孔板每孔加入150 μL稀釋的抗原包被酶標反應板，4 ℃過夜。次日用PBST洗滌3次，每次5 min；每孔加入200 μL含有質量分數為5%脫脂奶粉的PBST封閉，37 ℃ 2 h，洗滌同上；每孔加入150 μL按比例稀釋的抗血清(用2.5%脫脂奶粉稀釋)，37 ℃ 1 h，洗滌3次。每孔加入100 μL HRP標記的羊抗鼠IgG二抗(封閉液為1∶5 000)，37 ℃ 1 h，洗滌同上；加入100 μL TMB顯色液顯色10 min，最后每孔加入100 μL 2 mol·L-1終止液H2SO4，終止反應。酶標儀在450 nm波長下立即測定吸光值(OD)。

參照楊穎等(2011)的方法配制水溶性蛋白裂解液(100 mmol·L-1Tris，7 mol·L-1尿素，0.02 mol·L-1乙二胺四乙酸，65 mmol·L-1二硫蘇糖醇)，冰浴30 min。用滅菌的H2O沖洗干凈小胸鱉甲7齡幼蟲(末期幼蟲)，用液氮研磨后溶于抽提液中冰浴30 min。4 ℃ 12 000 r·min-120 min，上清液即為小胸鱉甲總蛋白。將小胸鱉甲的天然總蛋白和黃粉蟲天然總蛋白在SDS-PAGE分離，轉移到PVDF膜上，經過一抗(MpecCu/Zn-SOD抗血清)和二抗(HRP)處理后于DAB中顯色，顯色時間約為2 min，并拍照。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的純化

經SDS-PAGE檢測，沉淀中包含大量重組蛋白，以不溶于水的包涵體形式存在(圖1：A)。將含有pET32a-MpecCu/Zn-SOD表達質粒的BL21(DE3)菌體超聲破碎，將上清加載到親和柱上，以不同濃度咪唑洗脫，SDS-PAGE檢測結果顯示，Trx-His-MpecCu/Zn-SOD能被20 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1、120 mmol·L-1濃度咪唑的洗脫液洗脫，其中120 mmol·L-1為最佳洗脫濃度(圖1：A)。以Anti-his抗體作為一抗，用HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，鑒定純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，結果顯示，雜交出的條帶大小與預計的42 kDa相符合(圖1：B)，進一步說明誘導及純化的重組蛋白是目的重組蛋白。

2.2 純化重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的部分酶學性質

純化后的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD濃度為1.33 mg·mL-1，酶活性為27.52 U·mg-1。在不同溫度下處理30 min后，重組Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的活性在35 ℃最高，為13.05 U·mg-1；與其他溫度下測得的酶活性比較，在25～45 ℃保溫30 min后的MpecCu/Zn-SOD的酶活性穩定，相對酶活性保持在65%以上；低溫和高溫處理均會導致該酶活性的減弱，在65 ℃高溫處理后，相對酶活性迅速降至幾乎為0(圖2：A)。pH值為5.0～9.0時，Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的酶活性隨著pH值升高逐漸升高，pH為9時的酶活性最高；當pH>9時，酶活性則隨著pH值升高迅速降低(圖2：B)。

圖1 重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的誘導表達與純化Fig. 1 Induced expression and purication of fusion Trx-His-MpecCu/Zn-SOD protein

M.蛋白Marker； A. SDS-PAGE分析結果： 1. 未誘導的細菌總蛋白， 2. 誘導的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD總蛋白， 3. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD裂解上清， 4. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD裂解沉淀， 5～9. 20 mmol·L-1、50 mmol·L-1、75 mmol·L-1、100 mmol·L-1和120 mmol·L-1咪唑濃度洗脫液洗脫的蛋白條帶； B. Western blot分析結果： 1. 未誘導的細菌總蛋白， 2. 誘導的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD總蛋白

M. protein Marker； A. result of SDS-PAGE analysis： 1.uninduced bacterial total protein， 2. induced Trx-His-MpecCu/Zn-SOD total protein， 3. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD lysis supernatant， 4. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD lysis deposit， 5-9. protein strip eluted by 20 mmol·L-1， 50 mmol·L-1， 75 mmol·L-1， 100 mmol·L-1和120 mmol·L-1imidazole concentration eluent， respectively； B. result of Western blot： 1. uninduced bacterial total protein， 2. induced Trx-His-MpecCu/Zn-SOD bacterial total protein

圖2 溫度(A)和pH(B)對重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD 酶活力的影響Fig. 2 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of fusion Trx-His-MpecCu/Zn-SOD protein

2.3 ELISA檢測抗血清的效價

用重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD免疫小鼠3次后，ELISA方法測定抗血清效價(圖3)。當血清稀釋819 200倍時，樣品在450 nm的光吸收值大于陰性對照的2.1倍，即抗血清的滴度約為819 200。

圖3 ELISA測定Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清效價Fig. 3 ELISA assay for Trx-His-MpecCu/Zn-SOD antiserum titer

2.4 Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清免疫特異性檢測

以制備的抗Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，以大腸桿菌DH5α菌體重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD、小胸鱉甲總蛋白和黃粉蟲總蛋白作為抗原進行Western blot分析。結果顯示，所制備的抗血清能夠與重組蛋白結合且與預期條帶大小相符(42 kDa)(圖4：A)，也能與小胸鱉甲體內天然的MpecCu/Zn-SOD結合，條帶大小與理論大小相符(23 kDa)，而與黃粉蟲的總蛋白無雜交條帶(圖4：B)。表明制備的抗Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的抗血清對小胸鱉甲體內的MpecCu/Zn-SOD具有較好的免疫特異性。

3 討論

SOD作為生物體內抗氧化系統的重要防線，在昆蟲等節肢動物適應環境脅迫過程中發揮著至關重要的作用(Yangetal.，2010)。研究表明，當各種環境脅迫，包括低溫使昆蟲體內電子傳遞鏈受到損傷，產生大量的O2·-時，其體內的胞外Cu/Zn-SOD(ecCu/Zn-SOD)發揮著重要的抗氧化防御功能(岳宗豪等，2014；劉云財等，2018)。目前有關昆蟲的研究主要集中在icCu/Zn-SOD，而對ecCu/Zn-SOD的作用機制研究較少(劉云財等，2018)。小胸鱉甲作為古爾班通古特沙漠的特有種，體內的ecCu/Zn-SOD是否能在抵抗外界寒冷的環境中發揮作用需要進一步通過分子生物學的手段來證明，而制備特異性強、高效價的ecCu/Zn-SOD抗體是深入開展相關研究的基礎之一。本文將小胸鱉甲ecCu/Zn-SOD構建至pET-32a表達質粒上，在大腸桿菌中成功誘導出重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD。誘導出的重組蛋白在大腸桿菌主要以包涵體的形式存在于沉淀中，通過Ni2+親和層析純化得到比較單一的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD，用尿素復性后，測得的蛋白濃度為1.33 mg·mL-1，活力為27.3 U·mg-1，Western blot的結果驗證該重組蛋白的正確性。

圖4 Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清的免疫特異性檢測
Fig. 4 Immunospecific detection of Trx-His-MpecCu/Zn-SOD antiserum

M.蛋白Marker； A. Western blot分析結果： 1. 未誘導細菌的總蛋白重組蛋白， 2. Trx-His-MpecCu/Zn-SOD； B. SDS-PAGE分析結果： 1. 黃粉蟲總蛋白， 2. 小胸鱉甲總蛋白； C. Western blot分析結果： 1. 黃粉蟲總蛋白， 2. 小胸鱉甲總蛋白

M. protein Marker； A. result of Western blot： 1.uninduced bacterial total protein， 2. fusion protein Trx-His-MpecCu/Zn-SOD； B. result of SDS-PAGE analysis： 1.Tenebriomolitortotal protein， 2.Micorderapunctipennistotal protein； C. result of Western blot： 1.T.molitortotal protein， 2.M.punctipennistotal protein

Cu/Zn-SOD是一種金屬蛋白酶，酶活性受到pH、溫度等因素的影響(田春美，鐘秋平，2005)。柑桔全爪螨Panonychuscitri重組蛋白ecCu/Zn-SOD在25～70 ℃表現出廣泛的溫度耐受性(Fengetal.，2015)。翹嘴鱖Sinipercachuatsi重組蛋白Cu/Zn-SOD在25～60 ℃保持75%以上的酶活性(肖俊等，2017)。本研究中小胸鱉甲ecCu/Zn-SOD在25～45 ℃具有比較穩定的酶活性，低溫和高溫處理能夠減弱該酶活性，可能是因為純化獲得的重組蛋白是以包涵體的形式存在，需要進行變性和復性。有研究表明，通過生物提取的icCu/Zn-SOD和ecCu/Zn-SOD相比，復性的ecCu/Zn-SOD熱穩定性顯著降低(朱希強，袁勤生，2005)。尤其是大腸桿菌表達及純化并變性復性后的MpecCu/Zn-SOD僅在10～50 ℃有酶活性。溫度高于60 ℃，其穩定性開始迅速降低。這與本研究結果一致。

天然形式Cu/Zn-SOD酶結構在pH5.3～9.5保持不變，顯示出極強的穩定性(Salin & Oesterhelt，1988)。大多數重組蛋白Cu/Zn-SOD在pH2.0～10.5均具有很高的酶活性(劉建榮等，2007；Baoetal.，2009；Xuetal.，2010；肖俊等，2017)。另外斑馬魚Daniorerio的重組蛋白Cu/Zn-SOD在pH7.5～11均具有很高的酶活性(Kenetal.，2003)。本研究中MpecCu/Zn-SOD也表現出比較廣泛的酸堿耐受性，表明其酶活性相對穩定。另一方面，以純化的重組蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD作為抗原，通過 3次免疫小鼠，最終獲得滴度高于1∶819 200的抗血清，且特異性較好。Western blot結果顯示，制備的Trx-His-MpecCu/Zn-SOD抗血清對大腸桿菌總蛋白中的重組蛋白體進行抗體特異性檢測時，出現一些雜帶，但目的條帶相對明顯。Trx-His-MpecCu/Zn-SOD的抗血清能與小胸鱉甲的天然ecCu/Zn-SOD免疫特異性結合，但不能與黃粉蟲的蛋白結合，表明抗血清具有免疫特異性，為后期進行昆蟲耐寒性機制和蛋白功能研究提供重要的免疫檢測工具。