西南鳶尾花色變異實時定量PCR內參基因的篩選與驗證

馬璐琳 崔光芬 王祥寧 賈文杰 段 青杜文文 王繼華 陳發棣

(1 云南省農業科學院花卉研究所/云南省花卉育種重點實驗室/國家觀賞園藝工程技術研究中心,云南 昆明 650205；2 南京農業大學園藝學院,江蘇 南京 210095)

實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RTqPCR)具有定量準確、特異性強、敏感度高、重復性好等特點已被廣泛運用于目標基因表達水平的檢測和定量研究,但其結果的準確性易受RNA 質量、反轉錄效率、引物特異性、樣品量、PCR 效率等因素的影響[1-3],因此,需要引入內參基因進行標準校正,以提高RTqPCR 結果的準確性[4]。 目前一般以微管蛋白基因(Tubulin,TUB)[5-7]、肌動蛋白基因(Actin,ACT)[1,8-10]、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)[1,9-11]、泛素蛋白基因(Ubiquitin,UBQ)[5-9]、18S 核糖體RNA 基因(18S rRNA,18S)[1,10-12]等表達較高且穩定的看家基因(house-keeping gene)作為內參基因。 理想的內參基因在所有類型組織或細胞中,其基因表達水平應當不受環境因素影響,保持穩定表達[3],然而目前尚未有內參基因可以在各種試驗條件下均能穩定表達[13-16],因此,根據不同的物種、樣品類型、試驗條件篩選適合且穩定的內參基因具有重要意義[3,8,17]。

鳶尾屬(IrisL.)植物的花色除了白、紅、粉、黃等常見色外,還有在其他花卉中少見的藍紫色,且有些鳶尾屬種類花色多為復色,或帶有條紋和斑點,有極高的觀賞價值[18]。 鳶尾屬植物中有很多花色發生變異的變種和變型,如白花鳶尾(I.tectorumMaxim.f.albaMakino)[19]、白花溪蓀(I.sanguineaDonn ex Horn.f.albifloraMakino)[19]、白蝴蝶花(I.japonicaThub.f.pallescensP.L.Chiu et Y.T.Zhao)[19]、白花紫苞鳶尾(I.ruthenicaKer-Gawl.f.leucanthaY.T.Zhao)[19]、白花寬柱鳶尾(I.latistylaY.T.Zhao f.albifloraJ.Luo)[20]、黃花馬藺(I.lacteaPall.var.chrysanthaY.T.Zhao)[19]、藍花卷鞘鳶尾(I.potaniniiMaxtm.var.ionanthaY.T.Zhao)[19]、藍花喜鹽鳶尾[I.halophilaPall var.sogdiana(Bung) Grubov][19,21]等,這些都是研究鳶尾屬植物花色形成和調控機制及花色合成相關基因功能的理想材料[21-22]。 西南鳶尾(I.bulleyanaDykes)為鳶尾屬多年生宿根植物,僅分布于我國西南地區,如四川、云南等地,花色為淺紫至藍紫,可直接用作園林綠化,也可用來培育鳶尾新品種[19,23],其白花變型白花西南鳶尾(I.bulleyanaDykes f.albaY.T.Zhao)花色為乳白色,其他性狀與西南鳶尾相同[19]。目前對西南鳶尾的研究主要集中在系統分類、引種栽培、生長發育特性、內含物質組成等方面,而對其花色形成相關基因的篩選克隆及花色形成分子機制等方面尚未見報道。

本研究根據前期已完成的西南鳶尾及其白花變型花蕾組織的轉錄組測序數據,篩選適用于西南鳶尾及其花色變異材料中花色素合成代謝途徑相關基因表達譜分析的內參基因,以期為鳶尾花色形成(或變異)機制研究、花色相關基因功能分析及鳶尾花色育種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為自然生長于云南省香格里拉縣郊外的野生西南鳶尾及其白花變型白花西南鳶尾,在花期選擇發育程度、大小、長度等基本一致,花朵部分約有一半露出苞片的花蕾(圖1),去除花蕾基部花梗和苞片后立即-80℃液氮保存備用。 2 種不同花色材料各設3 個生物學重復,共6 個樣品。

圖1 西南鳶尾和白花西南鳶尾花蕾Fig.1 The flowers and buds of I.bulleyana Dykes and I.bulleyana Dykes f. alba Y.T.Zhao

1.2 方法

1.2.1 侯選基因篩選 根據前期已完成的西南鳶尾和白花西南等尾花蕾組織的轉錄組測序結果數據(未發表),以估算基因表達量FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)值較高(轉錄組測序結果以FPKM 值大于60 作為目標基因表達明顯的指標,本研究候選內參基因篩選標準為大于600)且在6 個樣品間基本一致作為篩選標準,共篩選到6 個常用的內參基因(表1),同時以臺灣百合(Lilium formosanumWallace) 18S基 因(GenBank：D29775.1)作為來源于轉錄組測序數據內參基因的對照內參基因。 此外,根據轉錄組測序KEGG 數據,選取類黃酮/花青素合成途徑和類胡蘿卜素合成途徑中的12 個色素合成相關基因(其中有3 個基因在西南鳶尾和白花西南鳶尾中差異表達)(表2),對最終篩選到的內參基因進行驗證。 根據候選基因核苷酸序列采用Roche LCPDS2 軟件設計RT-qPCR 引物(表3),由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

表1 西南鳶尾轉錄組測序數據中篩選到的6 個候選內參基因Table1 6 candidate reference genes in RNA-seq libraries of I.bulleyana

表2 西南鳶尾轉錄組測序數據中的類黃酮/花青素合成途徑和類胡蘿卜素合成途徑中的部分相關基因Table2 Part of velated genes in the flavonoid/anthocyanin biosynthetic and carotenoid biosynthetic pathways in RNA-seq libraries of I.bulleyana

表3 本研究所用引物Table3 Primers used in this study

1.2.2 總RNA 提取及cDNA 合成 按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提取西南鳶尾和白花西南鳶尾花蕾組織總RNA,取部分總RNA 采用NanoDrop 2 000 分光光度計(Thermo,美國)檢測濃度及OD260/OD280 值,經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。取0.5 μg 總RNA 按照HiScript ⅡQ RT Super Mix for qPCR(南京諾唯贊生物科技有限公司)說明書進行cDNA 合成,將合成的cDNA 稀釋10 倍后于-20℃保存備用。

1.2.3 候選內參基因RT-PCR 分析 以已合成的cDNA 為模板,用2×Taq Master Mix 進行反轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)。 反應體系包括cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,2×Taq Master Mix 10 μL,ddH2O 7 μL。 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,30 個循環；72℃延伸10 min,4℃保存。 取5 ～10 μL PCR 產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 候選內參基因 RT-qPCR 分析 利用QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit(Qiagen,德國)試劑盒于LightCycler? 480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀(羅氏,瑞士)上進行RT-qPCR 反應,每反應設置3 次生物學重復。 反應體系包括cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL,2× QuantiFast? SYBR? Green PCR Master Mix 5 μL,Nuclease-free H2O 3.6 μL。 反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40 個循環。 循環結束后利用熔解曲線檢測產物特異性,從60℃緩慢升溫至97℃,每升溫1℃采集5 次熒光信號。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2016 對原始Ct值進行統計計算得出平均Ct值。 利用geNorm、Normfider 和Bestkeeper 軟件分析候選內參基因在西南鳶尾和白花西南鳶尾 6 個樣品中的穩定性。 geNorm 和NormFinder 軟件根據原始Ct值進行換算后計算得到各內參基因的表達穩定值,該值大小反映了基因穩定性的高低[24]。 采用BestKeeper 軟件分析各候選內參基因原始Ct值之間的標準差(standard deviation,SD)和變異系數(co-variance,CV)即可篩選出最適內參基因。 SD 和CV 值越小,基因表達越穩定,若SD 值大于1,說明該基因穩定性較差[24]。根據geNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件分析得到的候選內參基因的穩定性值,通過R 3.2.3 獲取其皮爾遜相關系數(pearson correlation coefficient,r)并繪制相關性熱圖。再采用幾何平均值法[25],根據各軟件得出的7 個候選內參基因穩定性排名的幾何平均數,利用Microsoft Excel 2016 計算7 個候選內參基因表達穩定性的綜合排名,通過綜合排名篩選出表現最穩定的候選基因。

采用2-ΔΔCt法[26]計算西南鳶尾藍/白花材料之間的基因表達變化,統計學分析采用平均數±標準差方式,兩組樣品之間比較采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05被認為具有統計學差異。 采用Microsoft Excel 2016 和R 3.2.3 軟件處理數據,并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 候選內參基因RT-PCR 分析

候選內參基因的RT-PCR 產物瓊脂糖電泳結果表明,7 個候選內參基因均為單一條帶,說明引物特異性良好。 7 個候選內參基因在西南鳶尾和白花西南鳶尾各3 個生物學重復共6 個樣品間的表達差異不明顯,與轉錄組測序結果相一致,初步判斷這7 個候選基因都比較適合作為內參基因。 7 個候選內參基因表達強度差異較明顯,其中18S表達最強,UBQ表達最弱(圖2)。

圖2 7 個候選內參基因RT-PCR 產物瓊脂糖凝膠檢測Fig.2 Agarose gel of RT-PCR products of 7 candidate reference genes

2.2 候選內參基因RT-qPCR 分析

RT-qPCR 分析結果表示,7 個候選內參基因的熔解曲線均為明顯的單一峰,不存在引物二聚體,說明每個內參基因引物的特異性好,專一性高,結果準確可靠,符合RT-qPCR 標準,該結果與RT-PCR 結果相一致。

對7 個候選內參基因在6 個樣品中的Ct值分布情況進行了分析,由圖3可知,7 個候選內參基因的平均Ct值介于9.10(18S)～22.52(UBQ)之間,波動范圍較大,單個候選內參基因在6 個樣品間的因的平均Ct差異較小。 Ct值與表達量成反比,因此18S的表達量最高,UBQ表達量最低,其他候選內參基因Ct值介于二者之間,均為中等表達量。 RT-qPCR 表達量分析結果與RT-PCR 結果相一致。

由表4可知,根據CV 值可初步判斷7 個候選內參基因的穩定性均較穩定,其中UBQ的CV(0.916%)最低,穩定性最高；18S的CV 最高,為1.932%,穩定性最低。

圖3 7 個候選內參基因的Ct 值分布Fig.3 Distribution of Ct value of 7 candidate reference genes in all samples

表4 候選內參基因Ct 值分析Table4 Analysis of the Ct values of candidate reference genes

2.3 候選內參基因穩定性分析

通過geNorm、Normfider 和Bestkeeper 軟件對7 個候選內參基因的穩定性進行分析。 geNorm 軟件是根據計算所得的平均表達穩定(average expression stability,M)值來表示候選基因的表達穩定性,M 值越小候選基因穩定性越好[8]。 geNorm 分析結果表明7個候選內參基因的M 值均較低(＜0.4),其中ACT的M 值最低,為0.249,穩定性最好,也最適合作為內參基因；18S的M 值最大,為0.370。 NomFinder 是根據候選基因的表達穩定值(stability value,SV)來表示候選基因的表達穩定性,SV 值越小,候選基因越穩定[8]。NormFinder 分析結果表明ACT的SV 值最小,穩定性最好；18S的SV 值最大,geNorm 與Normfider 分析結果完全一致。 BestKeeper 軟件是通過導入Ct值來計算獲得候選內參基因在所有樣品中的 SD 值。BestKeeper 分析結果表明18S的SD 值最小為0.130,穩定性最好；GAPDHSD 值最大為0.252,穩定性最低。BestKeeper 分析結果與geNorm 和Normfider 的分析結果差異較大。 利用Excel 對geNorm、Normfider 和Bestkeeper 3 個軟件分析出的7 個候選內參基因的穩定性排名幾何平均數進行綜合性評價,結果表明,ACT穩定性最好,最適合做為本研究的內參基因,β-TUB穩定性最低(表5)。 根據3 種軟件排名穩定性的r 值分析其相關性,結果發現geNorm 與NormFinder 的相關性最高(r=0.97),達到極顯著水平,而NormFinder 與Bestkeeper、geNorm 與BestKeeper 則均為負相關。

2.4 候選目標基因RT-qPCR 分析

以通過穩定性綜合評價得到的表現最穩定的ACT作為內參基因,對西南鳶尾及白花西南鳶尾中類黃酮/花青素合成途徑和類胡蘿卜素合成途徑中的12 個色素合成相關基因的表達量進行RT-qPCR 分析,結果表明,12 個花色合成途徑的相關基因中有3 個基因(unigene c174379_g1、c178689_g1 和c134319_g1)表現為顯著差異表達,且以西南鳶尾為對照,在白花西南鳶尾中unigene c174379_g1 下調表達最明顯,其他9個unigene 表達無差異(圖4)。 花色素合成相關基因表達量的RT-qPCR 分析結果與轉錄組測序分析結果相一致。

表5 候選內參基因穩定性分析Table5 Stability analysis of candidate reference genes

圖4 西南鳶尾花色素合成相關基因的RT-qPCR 分析結果Fig.4 The RT-qPCR expression pattern of the pigments synthesis related genes in I.bulleyana flower buds

3 討論

研究表明,植物中的色素類型主要為類黃酮/花青素(flavonoids/anthocyanins)、類胡蘿卜素(carotenoids)和甜菜堿素(betalains)3 種,每種色素合成過程均有多個相關基因參與[27-28]。 類黃酮/花青素和類胡蘿卜素這2 類色素通常會共存于同一植物體內從而使其花色更豐富[28],關于這2 類色素合成途徑的研究也相對較多。 鳶尾屬植物中一般以類黃酮/花青素和類胡蘿卜素2 種色素類型為主[22,29],鳶尾藍紫色系花色素主要是飛燕草色素(花青素類色素),橙色、黃色、粉色等色素是類胡蘿卜素[29]。 我國鳶尾屬植物約有近60 個種、13 個變種和5 個變型,變種和變型多為花色發生變異[19-20]。 在利用花色、果實顏色、葉色、種皮顏色等變異材料進行色素形成機制分析及目標基因篩選研究時常用到轉錄組測序技術,而對轉錄組測序結果中色素合成相關基因表達量的分析驗證則多通過RTqPCR 來完成[30-32],合適的內參基因是提高RT-qPCR結果準確性的重要前提。

對于色素合成途徑中相關基因的表達譜分析,研究者所選用的內參基因也存在一定差異。 對于類黃酮/花青素合成途徑相關基因在不同花色、果色等材料之間的表達分析常用的內參基因有ACT[30-31]、TUB[21-32]、AQP[33-34]等；在類蘿卜素合成途徑相關基因的表達分析上,常用的內參基因有UBQ[35]、轉錄延伸因子基因(Elongation Factor1a,EF1a)[36]、ACT[37]和18S[29]等。 以上都僅是對類黃酮/花青素或類胡蘿卜素兩類色素合成途徑中的其中一個途徑進行分析,未同時對這兩類色素合成途徑中的相關基因表達譜進行分析,而這兩類色素在鳶尾屬植物中通常會同時存在。

本研究通過RT-PCR 和RT-qPCR 分析了7 個常用內參基因的表達量,結合3 個不同軟件分析它們的穩定性,綜合評價篩選出最穩定的內參基因為ACT,與前人研究結果一致[30-31,37]。 此外,進行RT-qPCR 分析試驗時,作為本底信號的3 ～15 個循環的熒光信號通常是由于測量的偶然誤差造成的,因此RT-qPCR 定量結果一般取Ct值在15～35 個循環的數據進行分析,Ct值過大或過小都會導致定量的不準確[38-39]。 本研究中18S表達量過高(Ct值為9.49),不適合作為RTqPCR 分析的內參基因,結合RT-PCR 電泳結果,該基因可能更適合用于RT-PCR 或核酸雜交(如Northern blot)分析。

Kou 等[2]根據轉錄組測序數據篩選到適合桃子(Prunus persicaL.Batsch)的內參基因PpMUB6；Liu等[3]利用轉錄組測序結果篩選到黑麥草(Lolium multiflorum)最穩定的內參基因Unigene14912；楊丹等[8]根據轉錄組測序數據篩選到適合于平歐雜種榛(Corylus heterophyllaFisch.×C.avellanaL.)的內參基因ChaActin和Ch18S rRNA。 本研究以篩選到的表現最穩定的ACT基因作為內參,對西南鳶尾轉錄組測序數據中篩選到的類黃酮/花青素和類胡蘿卜素兩類色素合成途徑中的部分相關基因表達量進行RT-qPCR驗證,發現RT-qPCR 結果與轉錄組測序結果相一致。表明本研究篩選出的內參基因不僅可用作西南鳶尾花色變異材料之間花色素合成相關基因表達分析的內參基因,也為鳶尾屬其他植物不同花色變異材料或品種間花色素合成相關基因表達量分析時內參基因的篩選提供了參考。 本研究也進一步證明,根據材料本身轉錄組測序數據來篩選內參基因比引用其他材料(或試驗條件下的)內參基因的穩定性更好,尤其是對于一些相關研究基礎比較薄弱的物種。 但本研究只選擇了與轉錄組測序所用材料一致的花蕾組織樣本對候選內參基因的穩定性及目標基因的表達量進行分析驗證。候選內參基因在西南鳶尾其他不同組織部位或同一組織不同發育時期樣品中是否也具有良好的穩定性還有待進一步驗證。

4 結論

本研究根據西南鳶尾和白花西南鳶尾的轉錄組測序數據,利用geNorm、Normfider 和Bestkeeper 軟件分析了7 個候選內參基因在西南鳶尾及其白花變型花蕾組織中的穩定性,篩選出1 個最穩定的內參基因Actin,以此基因為內參對西南鳶尾花色素合成途徑中部分相關基因表達譜的RT-qPCR 驗證結果與轉錄組測序數據完全一致。 該基因可作為西南鳶尾藍/白不同花色花蕾組織中花色形成相關基因表達分析時的內參基因。 本研究結果為鳶尾屬植物花色素合成相關基因表達分析內參基因的篩選以及鳶尾屬植物資源利用和花色育種研究提供了理論參考。