色譜-質譜聯用技術鑒定環孢素A的有關物質

倪悅泠，韓 興，宋 敏，杭太俊

（中國藥科大學藥物分析系，南京210009）

環孢素 A（cyclosporin A，環［［（E）-（2S，3R，4R）-3-羥基-4-甲基-2-（甲氨基）-6-辛烯酰］-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-纈氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-纈氨酰］，圖 1），是從真菌代謝產物中提取得到含11個氨基酸殘基的環肽免疫抑制劑。臨床上主要用于肝、腎以及心臟移植的抗排異反應，預防及治療骨髓移植時發生的移植物抗宿主反應［1］，也是目前眼科應用最多的一種免疫抑制劑類可供眼表使用的抗炎藥物，可治療干眼癥、結膜炎，抑制角膜移植排異反應［2-4］。此外，環孢素還可用于重癥肌無力、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、特發性血小板減少性紫癜、潰瘍性結腸炎、慢性腎炎和腎病綜合癥等多種自身免疫性疾?。?-8］。

中國及主要發達國家現行藥典已收載環孢素A及其制劑的質量標準，歐洲藥典還列出其A、B、C 3類共12個雜質和結構。已有文獻報道了環孢素 A制劑質量研究［9-11］及藥代動力學研究［12-14］，但是，環孢素A原料藥有關物質的系統研究與鑒定未見文獻報道。

Figure 1 Chemical structure of cyclosporine A

本研究建立了適用于環孢素A有關物質檢查的色譜-質譜聯用分析方法，通過TOF／MS測定了環孢素A各有關物質的準確分子質量及分子式，結合MS／MS的子離子特征，綜合解析鑒定其有關物質的結構，可用于環孢素A的發酵工藝和成品的質量控制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

環孢素A原料藥（批號180301HB，江蘇九陽生物制藥有限公司）；環孢素 A粗品（批號WCP180101，江蘇九陽生物制藥有限公司）；環孢素A對照品（EP）；環孢素色譜分離度對照品（USP，環孢素 U-環孢素，1∶100）。

乙腈、甲基叔丁基醚（美國Tedia公司）；甲酸（AR，南京化學試劑股份有限公司）。自制純凈水。

1.2 儀 器

Agilent 1290 Infinity液相色譜-6224飛行時間質譜儀（美國 Agilent公司）；Thermo Dionex Ulti-Mate 3000高效液相色譜-TSQQuantum Ultra型LCMS／MS聯用儀（美國 Thermo-Fisher公司）；BS 21S分析天平（德國Sartorius公司）。

2 方 法

2.1 色譜及質譜條件

Thermo Scientific BDS Hypersil C18（100 mm×4.6 mm，2.4μm）色譜柱；乙腈-水-甲基叔丁基醚-甲酸（430∶520∶50∶1）流動相等度洗脫，流速0.8 mL／min，柱溫80℃，檢測波長為210 nm，進樣量20μL。

電噴霧正離子化，TOF／MS測定噴霧電壓3.5 kV，霧化氮氣壓力 275 kPa，流量 10 L／min，溫度350℃，碎片電壓200 V，參比離子m／z121.050 8（質子化嘌呤，C5H5N4+）和m／z922.009 8（質子化氟代膦嗪HP-921，C18H19O6N3P3F24+），質量數掃描范圍m／z100～1 300。MS／MS測定的噴霧電壓4 kV，霧化氣壓力300 kPa，輔助氣壓力35 kPa，毛細管溫度350℃，二級質譜掃描碰撞氬氣壓力0.16 Pa，碰撞能量30～60 eV。

2.2 供試品溶液的制備

取環孢素A約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加乙腈-水（70∶30）稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質量濃度為2.5 mg／mL的供試品溶液。精密量取上述溶液適量，加稀釋劑定量稀釋，配制0.1%的自身對照溶液。

2.3 對照品溶液的制備

取環孢素A對照品約25 mg，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋成質量濃度約為2.5 mg／mL的溶液作為環孢素A對照品溶液。

取環孢素色譜分離度對照品（含環孢素U-環孢素，1∶100）25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋制成含環孢素A和環孢素U的質量濃度分別約為2.5 mg／mL和25μg／mL的混合溶液，用于供試品中環孢素U的定性。

2.4 強制降解試驗溶液

取環孢素A約25 mg兩份，加入稀釋劑0.5 mL溶解后，分別經1 mol／L鹽酸溶液0.5 mL 60℃水浴4 h、或1mol／L氫氧化鈉溶液0.5mL 60℃水浴1 h處理后，分別中和后加稀釋劑稀釋至10 mL，配制成質量濃度約為2.5 mg／mL的酸、堿強制降解試驗溶液。

取環孢素A約25 mg，經30%過氧化氫1 mL 60℃水浴52 h，然后加稀釋劑溶解并稀釋至10 mL，配制成質量濃度約為2.5 mg／mL的氧化強制降解試驗溶液。

取環孢素A約25 mg，經120℃烘箱放置5 d，加稀釋劑溶解并稀釋至10 mL，配制成質量濃度約為2.5 mg／mL的高溫強制降解試驗溶液。

同時進行空白試驗，制備空白對照。

3 結果和討論

3.1 有關物質檢查

建立的環孢素A有關物質揮發性流動相HPLC檢查方法適用于質譜聯用鑒定?，F行藥典所使用的乙腈-甲基叔丁基醚-水流動相體系分離效果較好，嘗試將甲基叔丁基醚更換為甲醇，或使用四氫呋喃，對分離度及柱效均無改善。色譜條件中柱溫是影響分離的關鍵因素，低于80℃柱溫，環孢素A及各有關物質的保留時間均增加，峰展寬嚴重，分離變差。本研究優化了流動相中有機相種類、比例，嘗試添加三氟乙酸和緩沖鹽體系，分離均未改善。最終確立的色譜條件可盡早洗脫出各有關物質，色譜分離較好。

圖2為環孢素A原料藥、粗品及其強制降解溶液的HPLC-UV譜圖。采用0.1%自身對照法估算有關物質的含量，按保留時間由小到大順序對含量大于0.1%主要雜質進行識別和編號，共檢出分離效果較好的29個主要有關物質，其中有關物質9、10、12、14、15、16、17、18、19、20、23、24和 27與EP中列出的9個已知結構雜質（或其光學異構體）相應。

環孢素A原料藥供試品共檢出2個有關物質（21、23，圖2-c）。環孢素A粗品共檢出9個有關物質（9、10、12、15、19、21、23、24和 28，圖 2-h）。強制降解試驗結果表明，本品對強酸、強堿、氧化、高溫條件均具有一定敏感性，對光照條件較為穩定。酸破壞形成3個主要降解產物（13、25和26，圖2-d）；堿破壞形成4個主要降解產物（2、11、16和19，圖2-e）；氧化破壞形成2個主要降解產物（4和8，圖2-f）；高溫破壞形成15個主要降解產物（1、3、4、5、6、7、8、14、17、18、19、20、22、27和 29，圖2-g）。

Figure2 HPLC-UV chromatograms of cyclosporin A（a.Reference solution of0.1%；b.Reference solution of1.0%；c.API）and its stressed solutions（d.Acid；e.Alkaline；f.Oxidation；g.Thermal；h.Crude）

3.2 有關物質的結構鑒定

采用LC-TOF／MS測得各有關物質母離子的準確質量和離子組成，三重四極質譜測得它們的二級質譜特征碎片，并通過與環孢素A和環孢素U的質譜特征的對比分析，鑒定各主要有關物質的結構。結果見表1和圖3。

3.2.1 環孢素質譜裂解規律 通過對環孢素A對照品及色譜分離度對照品中環孢素A、環孢素U進行一級質譜母離子準確質量（圖4）、二級質譜特征碎片離子進行分析，總結出環孢素母核一般裂解規律（圖5～圖7），從而輔助未知有關物質結構的推斷。

Table 1 Related substances of cyclosporin A identified by LC-MS

（Continued）

Figure 3 Chemical structures of the related substances（RSs1 29）of CsA

Figure 4 ESI-MSTIC chromatogram obtained from cyclosporine A resolution mixture（2.5 mg／mL）

環孢素A ESI+-TOF／MS測得環孢素A的［M+H］+準確質量為 1 202.851 4，與離子式C62H112N11O12+相應，相對分子質量為1 202.6。測得［M+H］+的ESI+-MS／MS主要特征碎片離子m／z1 184.8、1 099.8、1 071.8、1 057.7、944.7、834.6、821.6、806.6、693.5、675.5等。m／z1184.8與母離子脫水生成的［P-H2O］+特征碎片離子相應；m／z834.6、821.6和806.6由母離子b／Y裂解丟失AA5（Val）+AA6（MeLeu）+AA7（Ala）+AA8（D-Ala）、AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）和AA7（Ala）+AA8（D-Ala）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）產生；m／z637.5由m／z821.6離子b／Y裂解丟失 AA1產生；m／z1 099.8、1 071.8、944.7、693.5、675.5和 567.4分別由m／z1 184.8離子 b／Y裂解丟失 AA2（Abu）、AA11（MeVal）、AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）、AA1+AA2（Abu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）、AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）+AA6（MeLeu）和 AA1+AA2（Abu）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）產生。環孢素 A的二級質譜圖及推斷裂解途徑分別見圖5。

Figure5 MS／MSspectrum of［M+H］+ion and fragmentation pathways of CsA（m／z1 202.8）

環孢素U ESI+-TOF／MS測得環孢素U的［M+H］+準確質量為 1 188.831 8，與離子式C61H110N11O12+相應，相對分子質量為1 188.6。測得［M+H］+的 ESI+-MS／MS主要特征碎片離子m／z1 170.8、1 157.7、1 085.8、1 057.7、930.6、679.5、675.4、661.5、383.3等。環孢素 U的裂解規律與環孢素A相似，m／z1 170.8與母離子脫水形成的碎片離子相應；m／z679.5由母離子b／Y裂解丟失 AA7（Ala）+AA8（D-Ala）+AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）產生；m／z661.5為m／z679.5離子脫水生成的質量數為［M-18］+的特征碎片離子；m／z1 086.7、1 057.7和675.4分別由m／z1 170.8離子 b／Y裂解丟失 AA2（Abu）、AA11（MeVal）和 AA2（Abu）+AA3（MeGly）+AA4（MeLeu）+AA5（Val）+AA6（MeLeu）產生。環孢素U的二級質譜圖及推斷裂解途徑分別見圖6。

Figure 6 MS／MS spectrum of［M+H］+ion and fragmentation pathways of CsU（m／z1 188.8）

環孢素母核裂解規律如下：（1）鍵開裂的方式主要有 a／X、b／Y、c／Z 3種，由于所使用碰撞能較大，3種開裂產物均可能出現，氨基酸殘基上化學鍵也可能發生斷裂，因此環孢素A及其有關物質的質譜圖較為復雜。（2）環孢素A及其有關物質在AA1殘基β-OH易脫水生成質量數為［M-18］+碎片離子。（3）環孢素 A較易在 AA1-AA2、AA5-AA6、AA8-AA9、AA9-AA10和 AA11-AA1間肽鍵發生b／Y型斷裂。（4）環孢素A、環孢素U及其他有關物質的二級質譜大多產生相同質荷比的小于m／z650的碎片離子。根據肽類化合物氨基酸殘基裂解規律，推斷它們均為相同結構（圖7），提示這些有關物質與環孢素A有大致相同的氨基酸組成及多肽片段。但是，由于不同有關物質中價鍵能量的差異、二級質譜測定時碰撞電壓的不同，可能會使這些碎片離子峰簇的相對豐度此消彼長［15］。此類碎片離子只宜用于驗證結構推斷的正確性，而不能作為判定氨基酸序列的決定性依據。

3.2.2 有關物質的結構鑒定 ESI-MS總離子流色譜圖中，主成分及各有關物質均產生［M+H］+、［M+NH4］+、［M+Na］+單電荷分子離子峰，及［M+H+NH4］2+、［M+H+Na］2+等雙電荷峰（圖8）。本研究中，ESI-MS／MS均選擇［M+H］+或［M+NH4］+作母離子，以便二級質譜解析。

測得各有關物質母離子的準確質量和離子組成（表1），及它們的二級質譜特征碎片（圖9），并通過與環孢素A和環孢素U的質譜特征的對比分析，鑒定各主要有關物質的結構（表1，圖3）。

Figure 7 MS／MS common fragments（m／z＜650）of CsA and its typical RSs

Figure 8 ESI-MS full scan spectrum of CsA

Figure 9 MS／MS spectra of typical RSs of CsA

通過有關物質HPLC保留時間及質譜定性，確證有關物質12與色譜分離度對照品中環孢素U對應。檢測出的29個有關物質均與環孢素A有相似母核，根據結構將其大致分為以下幾類：

（1）環孢素家族及其立體異構體

有關物質9、10、12、14和15的結構分別與環孢素L、環孢素C、環孢素U、環孢素T和環孢素B相應；16和17與環孢素A／H及其光學異構體相應；27與異環孢素A相應；23和24與環孢素D及其光學異構體相應。

有關物質9 質量數比環孢素A少14，元素組成少 CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、930.6、679.5和661.5均與環孢素Am／z1 184.8、944.7、693.5和675.5相差14。推斷其甲基丟失在AA1的N上，與歐洲藥典收載的雜質環孢素L相應，為發酵工藝中產生。

有關物質10 質量數比環孢素A多16，元素組成多一個 O，與一個羥基相應。m／z1 200.8、1 087.7、960.6和 691.5均與環孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7和675.5相差16。確證其羥基帶在AA2上，為蘇氨酸（Thr）。該雜質與歐洲藥典收載的環孢素C結構相應，為發酵工藝中產生，含量較大。

有關物質12 其保留時間、準確質量、元素組成及特征碎片離子均與已知雜質環孢素U的基本相同。確證有關物質12即為環孢素U。

有關物質14 質量數比環孢素A少14，元素組成少CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、1 057.7和679.5與環孢素 Am／z1 184.8、1 071.8和693.5相差14，其甲基丟失在AA10的N上。推斷為環孢素A在高溫條件下，失去AA10上N-甲基產生，與歐洲藥典收載的雜質環孢素T相應。

有關物質15 質量數比環孢素A少14，元素組成少CH2。特征碎片離子m／z1 170.8、1 057.7、930.6、679.5、308.2和 237.2均比環孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7、693.5、323.2和 251.2小14；m／z862.6和806.6也為環孢素A碎片。推斷甲基丟失在AA1或AA2上，當其AA2為少一個甲基的丙氨酸（Ala）時，與歐洲藥典收載的雜質環孢素B相應，為發酵工藝中產生。

有關物質16／17 為環孢素A在堿性或高溫強制破壞條件下。質量數、主要特征碎片離子及裂解途徑與環孢素A均相同，推斷為環孢素A母核碳原子發生構型反轉產生的差向異構體。當AA11為D-甲基纈氨酸（D-MeVal）時與歐洲藥典收載的雜質環孢素H相應。

有關物質23／24 質量數比環孢素A大14，元素組成多 CH2。主要特征碎片離子m／z933.7、821.6、637.5等與環孢素A特征碎片離子相同；m／z1 198.9、1 085.8、958.7、707.5和 336.2比環孢素 Am／z1 184.8、1 086.7、944.6、693.5和322.2多14，推斷AA2殘基多一個甲基，為纈氨酸（Val）或2-氨基丁酸（Abu），但可能存在構型翻轉，故有不同保留。其中當AA2為L-纈氨酸（L-Val）時，為歐洲藥典收載的雜質環孢素D。均為發酵工藝中產生。

有關物質27 為環孢素A的同分異構體，其保留較強，極性較小。而環孢素AA1殘基上β-OH是其極性的重要影響因素，根據其主要特征碎片離子推測，其為環孢素A在高溫條件下AA1上β-OH與AA1-AA11間酰胺鍵羰基發生親核置換，縮合成酯產生。m／z1 184.8與母離子AA11-AA1間酯鍵水解后脫水形成的特征碎片離子相應；m／z1 118.8為母離子AA1殘基脫去一分子C6H12形成；m／z751.5為母離子裂解失去AA9（MeLeu）+AA10（MeLeu）+AA11（MeVal）形成。推斷其結構與歐洲藥典收錄的雜質C相同，為異環孢素A。其產生過程如圖11所示。

（2）肽鍵水解或丟失部分氨基酸

有關物質1為環孢素A在高溫條件AA1-AA11間肽鍵水解產生；有關物質13、25和26均由環孢素A在酸性條件下水解后丟失部分氨基酸片段產生。

有關物質1 質量數比環孢素A大16，元素組成多O，保留很弱，極性較大。m／z1 200.8比母離子m／z1 218.8小18，與母離子脫水相應，推測為環孢素A環狀結構開環水解含有游離羧基產物。m／z835.6為母離子脫去一分子HCOOH和AA1+AA2（Abu）+AA3（MeGly）產生；m／z710.6為m／z835.6 b／Y裂解丟失 AA4（MeLeu）產生。推斷該雜質為環孢素A在高溫條件下，AA1-AA11間肽鍵水解產生。

有關物質13 質量數比環孢素A少222，不飽和度減少3，其保留較弱，極性較大。碎片離子中m／z674.5、567.4、548.4、425.3、322.2、297.2、198.1、156.1等也為環孢素A的特征碎片離子，故雜質AA1～8與環孢素A相同；m／z710.5比環孢素Am／z693.5大17，與一個羥基相符，故其AA9存在游離羧基。推斷為環孢素A在強酸條件下水解，脫去AA10和AA11產生。

Figure 10 Formation reaction of RS 27

有關物質25 質量數比環孢素A大18，元素組成多H2O，不飽和度減1。特征碎片離子m／z1 022.7、895.6和782.5表明AA7存在游離羧基。推斷為環孢素A在強酸條件下，AA7-AA8間肽鍵水解形成。

有關物質26 質量數比環孢素A少95。主要特征碎片離子中m／z962.7、944.7、821.6、779.5、675.5、566.3等與環孢素 A相同；m／z839.6比環孢素Am／z821.6多18，證明 AA10存在游離羧基。推斷為環孢素A在強酸條件下水解，脫去AA11產生。

（3）N-去甲基化

有關物質9、12和14質量數比環孢素 A少14，元素組成少CH2，不飽和度不變。在粗品中存在，或在高溫條件下產生，均由環孢素A在氨基酸N位發生去甲基化產生。

（4）側鏈修飾

有關物質2 質量數比環孢素A少了112，不飽和度減1。特征碎片離子m／z963.7、850.6和581.4均比環孢素A特征碎片m／z1 157.7、944.7和675.5少94，與AA1殘基脫水后相對分子質量相應。推斷為環孢素A在堿性條件下AA1-α碳原子上殘基全部脫去產生。

有關物質3 質量數比環孢素A少56。推測AA1為2-氨基-3-酮戊酸。m／z1 116.7為母離子AA1殘基上脫去一分子C2H6產生。由于環孢素AA1-β-OH的存在，高溫條件下γ碳發生斷裂，丟失一個丁烯，羥基氧化成羰基形成該雜質。

有關物質4／7／8 其分子式及主要特征碎片離子相同，質量數均比環孢素A多16，元素組成多O，不飽和度不變。m／z1 200.8比環孢素A特征碎片m／z1 184.8多 16，與一個羥基相應；m／z1 105.8和978.7均比環孢素 Am／z1 071.8和944.7多34，與兩個羥基相應。為環孢素A在高溫或者強氧化條件下，AA1殘基烯鍵被氧化成ε-羰基產生（在此過程中母核易發生構型翻轉，因此有多種立體結構）。m／z1 188.8為母離子AA1殘基上開裂脫去一分子C2H6產生，進一步確證結構中羰基的位置。推斷有關物質4、7和8為環孢素A在氧化或高溫條件下產生。

有關物質5 質量數均比環孢素A多16，元素組成多O，不飽和度不變。m／z709.5和582.4均比環孢素Am／z675.5和566.4多16，與一個羥基相應，其AA1殘基與有關物質4／7／8有相同的羰基結構；m／z1 174.8為母離子AA1殘基丟失一分子CH2=CHOH產生。推斷其羰基位置在ζ位，為環孢素A在高溫條件下產生。

有關物質18／19／20 質量數均比環孢素A小18，元素組成少H2O，與脫一分子水對應。其中，有關物質19在粗品中存在，在高溫和強堿強制降解溶液中顯著增加。3個雜質主要特征碎片離子基本相同，也都是環孢素A的特征碎片離子，推斷均為環孢素A上AA1-β-OH脫去一分子水成烯鍵形成。在此過程中母核可能發生構型反轉，因此有多種立體結構，但三者的具體構型無法確證。當其碳原子構型與環孢素A完全相同時，為歐洲藥典收載的雜質B

有關物質21 質量數比環孢素A大2，元素組成多2H，不飽和度減1。其主要特征碎片離子m／z1 186.9、1 073.8、946.7和 677.5均比環孢素 Am／z1 184.8、1 071.8、944.7和 675.5大 2，m／z567.4、524.4等碎片離子與環孢素 A相同，證明AA1殘基上雙鍵還原。在環孢素粗A品及原料藥中均存在，為發酵工藝中產生。

有關物質28 質量數比環孢素A小16，與一個O對應，不飽和度不變。其保留比環孢素A強很多，極性較弱。主要特征碎片離子中沒有母離子脫水生成的［P-H2O］+離子，說明結構中無游離羥基。推斷其AA1為2-氨基-4-甲基-6-烯辛酸，在發酵工藝中產生。

有關物質29 質量數比環孢素A多12，不飽和度減少1，保留較強，極性很弱。主要特征碎片離子m／z1 101.8、974.7、818.6、705.5、578.4和479.3比環孢素 Am／z1 089.8、963.5、806.6、693.5、567.4和 467.3均大12，m／z352.2比環孢素Am／z322.2大30。推斷AA2殘基比環孢素A多一個甲基，且AA1-β-OH氧化成羰基。為高溫條件下產生降解雜質。

（5）縮酮反應

有關物質11 縮醛（酮）具有類似于醚的結構，在堿性介質中化學穩定性很好［16］。根據特征碎片離子，推斷為堿性強制破壞條件下，環孢素A肽鍵上羰基可與AA1支鏈上羥基發生半縮酮反應，產生有關物質11。其產生過程如圖12所示。

Figure 12 Formation reaction of RS 11

（6）其 他

有關物質6 質量數比環孢素A多5，不飽和度減1。推斷為環孢素A在高溫條件下，AA2-β碳氧化帶上羥基，同時AA5-AA6間肽鍵水解并失去一分子NH==CH2產生。

有關物質22 質量數比環孢素A小13，不飽和度不變，保留較強。根據分子式，其結構比環孢素A少一個C和一個N，多一個O，其主要特征碎片離子m／z1 171.8為母離子丟失一個羥基形成；m／z1 058.7正好為m／z1 171.8失去一個甲基纈氨酸（MeLeu）形成；m／z662.4比環孢素 A的m／z693.5少31，與脫去一分子NH==CH2同時出現雙鍵相符。推斷有關物質22為環孢素A高溫條件下脫去第1位氨基酸上NH==CH2，且羥基被氧化成羰基形成。

4 結 論

本研究建立了能有效檢測和分離環孢素A發酵過程及其強制降解產生29個有關物質的揮發性流動相LC-MS方法，并對這些有關物質進行了結構推測，對發酵工藝質量控制、評估藥物內在穩定性及制定存儲條件具有一定意義。

檢測出的有關物質根據來源可分為發酵工藝雜質和降解雜質，其產生途徑見圖13。環孢素A在發酵工藝過程中產生了9個有關物質（有關物質9、10、12、15、19、21、23、24和 28）；原料藥中兩個有關物質（有關物質21和23），含量均未超過藥典規定限度。

強制降解實驗表明，環孢素A在強酸條件下易發生肽鍵的水解反應，丟失部分氨基酸片段生成鏈狀多肽（有關物質13、25和26）；在強堿條件下，環孢素A可脫去殘基，肽鍵可與鄰近殘基上羥基發生縮酮反應，或降解成保留極弱的氨基酸片段（有關物質2、11、16和19）；在氧化和高溫條件下，環孢素A易發生N-脫甲基、殘基脫羥基等反應（有關物質 1、3、4、5、6、7、8、14、17、18、19、20、22、27和29）；環孢素A對光較為穩定，強光照射幾乎沒有新的雜質產生。故環孢素需于密封干燥處儲存。

Figure13 Generation of themain RSs of CsA