基于ITS2序列探討蘭屬的DNA條形碼鑒定和系統發育關系

巫偉峰，陳孝丑，陳發興，陳 春，張毅智

(1.福建省林業科技試驗中心，福建 南靖 363600； 2.貴州省植物園，貴州 貴陽 550000； 3.福州植物園，福建 福州 350000； 4.福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350000)

蘭屬(Cymbidium)是蘭科(Orchidaceae)植物中最著名且分布范圍最廣的一類[1]，全世界約有70種，中國約有49種[2]。因其具有獨特的美學魅力和文化雅趣，古往今來深受文人墨客的青睞，具有極高的觀賞和經濟價值，特別是春蘭、建蘭、墨蘭等國蘭系列。近年來，隨著蘭花產業的不斷發展，蘭屬種質資源數量逐年上升，包括原種、變種、雜交種、栽培品種或品系等類型，數量繁多，加之自然狀態下蘭屬植物種間雜交結實易發，且其自身容易發生變異，導致種間類型多、種間界限模糊[3]，大大增加了蘭屬植物分類鑒定和開發利用的難度。迄今為止，基于形態學標記建立的分類系統仍是蘭屬分類鑒定的主要依據[4]。但受個體發育、營養差異等因素影響，特別是在非生育期，同類型蘭花形態特征十分相似，要求鑒定者具有豐富的實踐經驗和專業知識，在實際應用中有很大局限性。因此，探尋一種快速、便捷、有效的分類鑒定策略十分必要，對蘭屬植物的物種鑒定、分子系統學等研究意義重大。

DNA條形碼(DNA barcoding)是利用基因組中一段公認標準的DNA片段來進行物種鑒定的分子診斷技術，該概念自加拿大分類學家Hebert[5]首次提出后，便受到各國科學家的廣泛關注，是目前植物分子系統學和鑒定學的研究熱點。相比傳統形態學鑒定方法，該技術可以避免非遺傳形態差異或趨同導致的物種鑒定誤差，不受鑒定對象的環境、個體發育和主觀臆斷等因素的制約[6]，僅需少量組織材料即有可能實現物種的分類識別。迄今，被提議的條形碼主要有COⅠ、rpoB、rpoC1、matK、rbcL、trnH-psbA、atpF-atpH、psbK-psbI、ITS、ITS2等核酸片段[7]。部分動植物已建立了較成熟的DNA條形碼鑒定技術體系，如基于ITS2的中草藥鑒定體系[7]、基于COⅠ的藥用動物鑒定體系[8]。2011年中國植物條形碼研究組通過對1 757種植物的psbA-trnH、ITS/ITS2、rbcL+matK序列或序列組合進行鑒別能力評價，提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼[9]。2014年，Chen等[10]通過對trnH-psbA、matK、rbcL、rpoC1、ycf5、ITS2和ITS共7個候選序列的擴增成功率、種內種間變異，以及Barcoding gap三方面進行比較分析，發現ITS2的表現最為突出，同時利用6 600份共753屬4 800種的植物樣本對ITS2的鑒定能力進行評估，結果顯示，ITS2在物種水平的鑒定成功率達到92.7%，因此，提出將ITS2序列作為藥用植物通用DNA條形碼序列。ITS2是真核生物核糖體DNA上的一段順反子，位于5.8S和26S的基因內轉錄間隔(ITS)區[11]，它在物種水平的變異較快，有更多的突變位點以區分不同的物種，在物種間具有顯著性差異[12]，已被廣泛應用于物種分類和系統進化研究[7]。至今，ITS序列在蘭屬的分類鑒定研究中仍鮮見報道。因此，本研究運用12個本地蘭屬樣品(2個建蘭、3個春蘭、4個墨蘭、2個春劍、1個蓮瓣蘭)、81條GenBank數據庫下載的蘭屬ITS2序列和169條其他蘭科ITS2序列樣本，通過BLAST1、遺傳變異、建樹法等分析，評估了ITS2序列用于蘭屬植物分子鑒定的應用潛力，并基于建樹結果探討了蘭屬植物的系統發育關系，旨在為蘭屬植物的快速鑒定、分子系統學研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

12份蘭屬本地樣品取自福建省林業科技試驗中心蘭花種質資源圃，通過形態學鑒定分別為建蘭(C.ensifolium)(復興奇蝶、鐵骨水晶)、春蘭(C.goeringii)(翠一品、宋梅、汪字)、墨蘭(C.sinense)(彩龍梅、青達摩、十八嬌、陽明錦)、春劍(C.goeringiivar.longibracteatum)(隆昌素、西蜀道光)、蓮瓣蘭(C.tortisepalum)(碧龍玉素)。根據劉仲健等[13]的《中國蘭屬植物》分類，除蓮瓣蘭為建蘭亞屬無關節組外，其余樣品均屬于建蘭亞屬建蘭組。取樣時，要求選擇無病蟲害的幼嫩葉片，使用70%乙醇對葉片表面進行表面清潔；取樣后，使用液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。另外，以GenBank下載的250條蘭科ITS2序列作為參考庫，其中包含81條蘭屬ITS2序列信息，具體見表1(分類參照《中國蘭屬植物》)，169條其他蘭科ITS2序列信息，見表2(分類參照《中國植物志：蘭科》[14])。

1.2 總DNA提取

稱取0.1 g葉片，用組織研磨儀(浙江托普YMY-200)研磨成粉末，使用北京天根高效植物總DNA提取試劑盒(DP350-03)提取基因組DNA，按照試劑盒說明書中操作步驟進行。

表1 GenBank下載的81條蘭屬ITS2序列信息

Table 1 Informations of 81 ITS2 sequences ofCymbidiumdownloaded from GenBank

亞屬Subgenus組Section種Species蘭亞屬蘭組CymbidiumC. aloifolium (gi21427016, gi387234507, gi11182031, gi332693261), C. bicolor (gi21427017)Cymbidium帶葉組HimantophyllumC. dayanum (gi21427018)多花組FloribundaC. floribundum (gi21427020, gi22087073, gi21427019),C. suavissimum (gi21427021, gi22087072)南蘭組AustrocymbidiumC. madidum (gi22087074)福蘭組BigibbariumC. devonianum (gi332693252)大花蘭屬Cyperorchis大花組IridorchisC. tracyanum (gi21427022), C. giganteum (gi332693260), C. insigne (gi21427028, gi11182032), C. erythraeum (gi21427024), C. hookerianum (gi332693257, gi21427025), C. wilsonii (gi21427026), C. iridioides (gi21427023), C. lowianum(gi332693254, gi11182033, gi21427027)腋花組EburneaC. mastersii (gi332693253, gi21427032), C. eburneum (gi332693259, gi21427031, gi21427030)紅柱蘭組AnnamaeaC. wenshanense (gi21427029)莎草蘭組CyperorchisC. elegans (gi332693256, gi21427033), C. cochleare (gi387234509)斑舌蘭組ParishiellaC. tigrinum (gi21427034, gi332693255)建蘭亞屬地生腋花組AxillariaC. cyperifolium (gi332693258, gi21427040)Jensoa建蘭組JensoaC. sinense (gi22087084, gi21427035, gi21427036, gi11182034, gi229609532), C. ensifolium (gi22087079, gi21427037, gi21427038, gi229609531, gi11182035), C. goeringii (gi532734669, gi532734613, gi532734693, gi11182045, gi532734579, gi532734608, gi532734564, gi532734707, gi532734594, gi532734679, gi532734645, gi532734657, gi532734624, gi532734634, gi21427043, gi11182050, gi11182051), C. kanran (gi21427041, gi11182043, gi11182042, gi11182041), C. defoliatum (gi21427039), C. gyokuchin (gi11182039, gi11182038, gi11182040), C. forrestii (gi11182049), C. rubrigemmum (gi11182046)無關節組NanulaC. faberi (gi21427042, gi11182037), C. tortisepalum (gi21427044)兔耳蘭組GeocymbidiumC. lancifolium (gi21427045, gi11182047, gi11182048)

表2 GenBank下載的169條其他蘭科ITS2序列信息

Table 2 Informations of 169 other ITS2 sequences of Orchidaceae downloaded from GenBank

族Trib name屬Genus name種名與GenBank gi編號Species name and GenBank gi number樹蘭族Epidendreae香莢蘭屬VanillaV. pompon(gi260401086, gi260401089, gi260401087, gi260401088), V. hybrid_cultivar (gi260401123, gi260401124, gi260401126, gi260401122), V. planifolia (gi260401091, gi260401092, gi260401094, gi260401095)蝦脊蘭屬CalantheC. arisanensis (gi58397781), C. aristulifera (gi58397782), C. triplicate (gi58397791, gi667794530), C. sylvatica (gi58397787, gi71142907, gi78126136, gi78126133, gi78126134, gi78126135, gi58397783), C. alismifolia (gi58397792)帶唇蘭屬TainiaT. cordifolia (gi667794539, gi667794540), T. macrantha (gi667794544), T. dunnii (gi667794541), T. minor (gi667794545), T. latifolia(gi667794542), T. longiscapa (gi667794543)足柱蘭屬DendrochilumD. dewindtianum(gi3386434, gi12659072), D. muluense(gi3386431), D. acuiferum(gi14719229, gi14719232, gi14719230, gi14719231), D. lancilabium(gi3386437), D. longira-chis(gi3386450), D. lacteum(gi3386452), D. glumaceum(gi3386440, gi6652550)石斛屬DendrobiumD. amoenum(gi300250529, gi695130324, gi300250531), D. aqueum(gi300250557, gi300250558, gi334382045), D. aphyllum(gi307000564, gi523586035, gi690376796), D. adun-cum(gi334382043, gi371945779, gi545669923), D. barbatulum(gi300250559, gi300250560, gi300250561)蘭屬Cymbidium見表1(不包含在169條其他蘭科ITS2序列內)Listed in table 1 (not included in 169 other Orchidaceae ITS2 sequences)萬代蘭族Vandeae擬萬代蘭屬VandopsisV. lissochiloides(gi60499606, gi84578765, gi71912908), V. gigantea(gi158534793), V. undulata(gi387234753, gi387234754)槽舌蘭屬HolcoglossumH. amesianum (gi339779444, gi339779445, gi194270885), H. flavescens (gi194270900, gi194270901, gi194270902), H. lingulatum (gi194270886, gi339779461), H. linearifolium (gi354685622), H. kimballianum (gi158534776, gi126789464)萬代蘭屬VandaV. tricolor (gi158534790, gi158534791, gi158534792), V. luzonica (gi71912899, gi37958083), V. pumila (gi158534789, gi194270909, gi84578762), V. coerulescens (gi60499605, gi194270910), V.testacea (gi387234751, gi387234749, gi387234750), V.flabellata (gi71912894, gi84578696, gi158534787)蝴蝶蘭屬PhalaenopsisP.sumatrana (gi37622247, gi37622249, gi37622251), P.tetraspis (gi27464723, gi60499591), P.violacea (gi38260591, gi38260597, gi37958072), P.bellina (gi38260600, gi38260601, gi58825879), P.wilsonii (gi71912891, gi84578743, gi27464741), P. viridis (gi29501545, gi60499593, gi60499595), P. stuartiana (gi27464706, gi60499590, gi37958080), P. amabilis (gi37223369, gi37223370, gi37223381), P. sanderiana (gi37223405, gi37223406, gi37223407), P. Aphrodite (gi37223390, gi37223393, gi37223395), P. taenialis (gi37958017)蘭族苞葉蘭屬BrachycorythisB. henryi (gi1321101765), B. obcordata (gi1321101766)Orchideae紅門蘭屬OrchisO. adenocheila (gi1143631384, gi1143631388, gi1143631385, gi1143631386, gi1143631387), O. mascula (gi1026286784, gi1143631377, gi1143631375, gi1143631376, gi1143631374, gi1026286793, gi1026284564, gi1143631378, gi1143631379)手參屬GymnadeniaG. conopsea (gi407894520, gi410112222, gi87294839, gi393192826), G. odoratissima (gi730046224, gi730046223, gi730046220), G. orchidis (gi1284844394), G.frivaldii(gi87294838, gi87294835), G.rhellicani (gi730046207)鳥巢蘭族翻唇蘭屬HetaeriaH. affinis (gi987894312), H. youngsayei (gi987894314)Neottieae綬草屬SpiranthesS. casei (gi1331391947, gi1331392205, gi1331392818, gi1331392982, gi1331392761), S. cer-nua (gi11528348)頭蕊蘭屬CephalantheraC. damasonium (gi37720891), C. longifolia (gi37720892), C. rubra (gi37720890)鳥巢蘭屬NeottiaN. cordata (gi1026285580, gi1026285720, gi1026286937, gi1331391997), N. nidus-avis (gi1026285435, gi1026286977), N. ovate (gi1026286831, gi1026287059, gi1331392422, gi1331393060)

1.3 ITS2序列擴增與測序

PCR反應程序在高連明等[15]的《關于植物DNA條形碼研究技術規范》基礎上進行了適當修改。PCR反應體系20μL∶10 μL 2×TaqMaster Mix，1 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，無菌水8 μL。引物序列[16]：S2F(5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’)，S3R(5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’)，委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應(BIO-RAD T100TMPCR儀)程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。采用質量體積分數1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測。PCR擴增產物經TIANGEN DNA純化回收試劑盒(DP214-03)純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行雙向測序。

1.4 數據分析

測序峰圖采用CodonCode Aligner V2.06(CodonCode.， USA)序列拼接軟件校對拼接。序列質量評價判斷方法參照國際DNA條形碼協會(CBOL)的通用標準[17]。將拼接得到的一致序列和GenBank下載的參考序列基于隱馬爾可夫模型HMMer真核生物注釋方法，去除序列兩端5.8S和26S區段，獲得ITS2間隔區序列[18]。通過ITS2條形碼數據庫網站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)進行BLAST1鑒定。用MEGA 7進行多序列比對、GC含量、遺傳變異等分析，并計算K2P遺傳距離，基于最大似然法(maximum likelihood， ML)和鄰接法(neighbor-joining， NJ)構建系統發育樹，插入/缺失不視為信息位點，以“missing data”處理，缺隙(gap)設置為完全缺失(complete deletion)，用自展法(bootstrap)進行重復1 000次支持率檢測，評估系統發育樹各分支的可靠性。Barcoding gap檢驗作圖分析采用Graphpad prism 7.0軟件。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與測序結果

如圖1，利用ITS2序列引物S2F和S3R，在12個樣品中均擴增出目的條帶，特異性良好，擴增成功率為100%。表明該引物具有良好的通用性。

M, DNA標準分子質量；1，建蘭復興奇蝶；2，建蘭鐵骨素梅；3，春蘭翠一品；4，春蘭宋梅；5，春蘭汪字；6，墨蘭彩龍梅；7，墨蘭青達摩；8，墨蘭十八嬌；9，墨蘭陽明錦；10，蓮瓣蘭碧龍玉素；11，春劍隆昌素；12，春劍西蜀道光。M, DNA standard molecular weight; 1， C. ensifolium Fuxingqidie; 2， C. ensifolium Tiegusumei; 3， C. goeringii ‘Cuiyipin’; 4， C. goeringii Songmei; 5， C. goeringii Wangzi; 6， C. sinense Cailongmei; 7， C. sinense Qingdamo; 8， C. sinense Shibajiao; 9， C. sinense Yangmingjin; 10， C. tortisepalum Bilongyusu; 11， C. goeringii var. Longibracteatum Longchangsu; 12， C. goeringii var. Longibracteatum Xishudaoguang.圖1 12個蘭屬樣品的ITS2序列PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis of ITS2 sequences from 12 Cymbidium samples

2.2 序列特征與鑒定效率

基于隱馬爾可夫模型對ITS2序列(包括本研究樣品和所有GenBank下載序列)進行HMMer注釋，獲得的ITS2序列長度介于222～271 bp，平均長度為255.9 bp。(G+C)含量介于46%～77%，平均(G+C)含量為63%。利用BLAST1鑒定方法對12個樣品進行鑒定，結果如表3所示，在屬、亞屬水平的鑒定成功率均為100%，組水平的鑒定成功率為92%，而種水平鑒定成功率僅17%。

2.3 遺傳變異分析

K2P遺傳距離計算結果顯示：屬內變異為0.064，屬內最大K2P遺傳距離為0.187；屬間變異為0.842，屬間最小遺傳距離為0.057；亞屬內變異為0.101，最大亞屬內遺傳距離為0.137；亞屬間變異為0.125，最小亞屬間遺傳距離為0.106；組內變異為0.740，最大組內遺傳距離為0.165，組間變異為0.113，最小組間遺傳距離為0.014；種內變異為0.128，最大種內遺傳距離為0.340，種間變異為0.121，種間最小遺傳距離為0。Barcoding gap檢驗結果(圖2)顯示，屬間變異和屬內變異分布存在明顯的gap(圖2-A)，屬間差異明顯大于屬內差異。組內變異和組間變異、種間變異和種內變異均沒有明顯的gap(圖2-B、2-C)，存在較大重疊。遺傳變異位點計算結果顯示，81條蘭屬參考序列共檢測到遺傳位點279個，變異位點有209，變異率為74.9%?？梢?，蘭屬ITS2序列具有很高的遺傳多樣性，在亞屬水平上尚能較好地區分開，由于高變異率，組內變異和組間變異、種內變異和種間變異的分布沒有明顯界限，導致對蘭屬的組、種水平區分不準確。

表3 12個樣品的BLAST1鑒定結果

Table 3 BLAST1 identification results of 12Cymbidiumsamples

樣品名Sample name種名Species屬Genus亞屬和組Subgenus and section種Species宋梅 SongmeiC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran 汪字 WangziC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran 翠一品 CuiyipinC. goeringiiCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran, C. goeringii隆昌素 LongchangsuC. goeringii var. longibracteatumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. goeringii var. Longibracteatum西蜀道光XishudaoguangCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. goeringii 青達摩 QingdamoC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi十八嬌 ShibajiaoC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi彩龍梅 CailongmeiC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi陽明錦 YangmingjinC. sinenseCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi碧龍玉素 BilongyusuC. tortisepalumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. kanran鐵骨水晶 TiegushuijingC. ensifoliumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi復興奇蝶 FuxingqidieC. ensifoliumCymbidiumSubgen. JensoaSect. JensoaC. faberi鑒定成功率100100,9217Identificationsuccess rate/%

2.4 建樹分析

A，250條參考庫序列的屬內和屬間Barcoding gap檢驗圖；B，蘭屬參考庫序列的組內和組間Barcoding gap檢驗圖；C，蘭屬參考庫序列的種內和種間Barcoding gap檢驗圖。A， Intra-and inter-generic Barcoding gap test diagram of 250 sequences from reference database; B， Intra-and inter-section Barcoding gap test diagram of Cymbidium sequences from reference database; C， Intra-and inter-species Barcoding gap test diagram of Cymbidium sequences from reference database圖2 Barcoding gap檢驗圖Fig.2 Barcoding gap test diagram

利用NJ法對蘭屬ITS2序列進行建樹分析，結果如圖3。由圖3-A的一致樹可知，在不同分類階元均獲得一些有效區分(支持率>50%)，如亞屬水平上的大花亞屬，組水平上的建蘭組、大花組、蘭組；物種水平上有C.tigrinum、C.floribundum、C.sinense，但12個樣品未能獲得有效鑒別；表明ITS2序列在蘭屬亞屬、組和物種水平上均具有一定的鑒別能力，但鑒別范圍有限，大部分序列在亞屬、組和物種水平上仍然未獲得有效鑒別。圖3-B的原始樹結果顯示，蘭屬中的建蘭亞屬、蘭亞屬和大花亞屬被明顯區分開，但不能準確區分組與組下水平；12個樣品中，除春蘭汪字外，其他均與建蘭亞屬樣本聚在一起。拓撲結構關系表明，建蘭亞屬與蘭亞屬親緣較近，兩者與大花亞屬親緣較遠。圖3-B的灰色方框內顯示，蓮瓣蘭(gi21427044)與8個春蘭參考樣本(gi532734564、gi532734634、gi532734657、gi532734707、gi532734624、gi532734645、gi532734679、gi532734594)聚在一個分支上(支持率69%)，可見蓮瓣蘭與春蘭之間親緣關系較近。

基于最大似然法構建所有參試ITS2序列的系統發育樹，結果如圖4所示。系統發育樹被分為4大分支，Cymbidium單獨組成分支Ⅰ(87%)，Calanthe(99%)、Dendrobium(63%)、Dendrochilum(98%)、Tainia(88%)組成分支Ⅱ；Hetaeria(98%)、Cephalanthera(77%)、Neottia(80%)、Spiranthes(93%)、Brachycorythis(91%)、Orchis(68%)、Gymnadenia(88%)組成分支Ⅲ；Vanda、Vandopsis、Phalaenopsis、Holcoglossum和Vanilla(100%)組成分支Ⅳ。除Vandopsis外，其他屬均在屬水平上形成單系分支。根據《中國植物志：蘭科》的分類學劃定，組成分支Ⅰ和分支Ⅱ的屬均屬于樹蘭族；分支Ⅲ中，Hetaeria、Cephalanthera、Neottia、Spiranthes4個屬為鳥巢蘭族，Brachycorythis、Orchis、Gymnadenia屬于蘭族；分支Ⅳ中，Vanda、Vandopsis、Phalaenopsis、Holcoglossum4個屬為萬代蘭族，Vanilla屬于樹蘭族。系統發育樹的拓撲結構與傳統系統學大體一致，12個蘭屬樣品都聚在Cymbidium分支，與形態學鑒定結果一致。

3 討論

3.1 ITS2序列鑒定蘭屬植物的應用潛力

理想的條形碼種間遺傳變異應明顯大于種內，并在兩者之間存在Barcoding gap[7]。ITS2序列作為分子系統進化研究中最重要的標記之一，在物種水平或種下水平具有明顯的序列變異[7]，是鑒別物種水平或種下水平的重要候選條形碼之一。本研究結果顯示，ITS2序列在蘭屬植物的屬水平、亞屬水平上具有較好的鑒別能力，而組和物種水平雖具有一定的鑒別能力，但鑒定成功率較低，這主要與蘭屬植物ITS2序列的高變異率有關。因此，我們認為ITS2序列適合作為蘭屬植物DNA條形碼鑒定分析的輔助條形碼。

3.2 蓮瓣蘭與春蘭的分類關系

在分類學上，蓮瓣蘭的歸屬問題一直頗受爭議，是獨立種還是春蘭下的一個變種，或者只是春蘭的品種，一直未有定論[19]。1980年，吳應祥等[20]將蓮瓣蘭作為春蘭種下的一個變種。1991年，吳應祥[21]又將蓮瓣蘭從春蘭中分出，與春蘭一起作為蕙組小花亞組下的一個種。蓮瓣蘭和菅草蘭是極為相似的植物，《中國植物志：蘭科》將蓮瓣蘭劃為菅草蘭的一個品種。由于春蘭葉的下部有關節，花序通常只具一朵花，而蓮瓣蘭葉的下部無關節，花序通常具3～5朵花，劉仲健等[13]將蓮瓣蘭從春蘭中移出來作為菅草蘭下的一個變種。本研究結果顯示，蓮瓣蘭(gi21427044)與8條春蘭參考序列(gi532734564、gi532734634、gi532734657、gi532734707、gi532734624、gi532734645、gi532734679、gi532734594)聚在一個有效分支上(支持率69%)，說明春蘭與蓮瓣蘭關系緊密，蓮瓣蘭可能是春蘭下的一個變種或品種。

A，一致樹；B，原始樹。A， Consensus tree; B， Original tree.圖3 基于ITS2序列構建的蘭屬NJ樹Fig.3 Cymbidium NJ tree based on ITS2 sequence

3.3 蘭屬植物的分類

蘭屬植物的分類經歷了一個艱難的發展過程，存在諸多不同版本的分類系統，在已發表的若干分類系統中，比較常見的有文獻[13， 22-25]的分類系統。德國形態學分類學家Shlechter R根據花序、蕊柱、唇瓣等特征將蘭屬植物分為8組[22]，除澳洲蘭組和二葉蘭組外，無葉蘭組、地蘭組、春蘭組、建蘭組、東鳳蘭組、真蘭組6組都有我國的蘭花。吳應祥等[20]以屬下體態、習性、苞片的長短，以及蕊柱長短等特征為依據，在Hunt[23]系統的基礎上把Shlechter[22]和Hunt[23]所承認的8個組合并為6組，分別為長苞組、短苞組、長柱組、垂花組、寬葉組和腐生組。Du Puy等[25]在其編著的《The GenusCymbidium》中將全世界蘭屬植物44個種分為3個亞屬15組，其中，分布在我國的蘭屬有10組22種。之后，《中國蘭花全書》[26]、《中國植物志：蘭科》[14]、《中國蘭屬植物》[13]等著作中均認為Du Puy & Cribb系統[25]比較自然和現代，在該系統基礎上進行完善與增補。本研究的蘭屬ITS2序列建樹分析結果顯示，絕大部分的ITS2序列都能按照所屬亞屬被明顯區分開，這從分子水平進一步支持了Du Puy & Cribb系統的3亞屬分類觀點。

綜上所述，ITS2序列可以為蘭屬植物的分子鑒定、親緣關系、系統發育關系等研究提供有價值的參考，但鑒于ITS2在蘭屬的組或組下水平鑒別能力較弱，我們建議將其作為蘭屬植物DNA條形碼鑒定的輔助條形碼。

圖4 基于最大似然法與ITS2序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on maximum likelihood method and ITS2 sequences