GPR30在子宮肌瘤組織中的表達

朱虹 徐學麟 江秀秀 葉小磊 林俊*

作為女性生殖器最常見的良性腫瘤，子宮肌瘤的病因目前尚未明確。有研究指出G蛋白偶聯受體（GPR30）通過影響細胞周期的進程或導致細胞增殖等作用模式，在一些雌激素相關惡性腫瘤的發生發展中可能起一定作用［1］。目前在子宮內膜、胎盤、心臟、乳腺、神經、卵巢、骨組織及前列腺中均發現GPR30。Smith等［2］報道在卵巢癌和子宮內膜癌中GPR30有所表達，認為其可作為預測患者預后的依據。有研究發現GPR30不僅在大鼠子宮肌層中表達，且在剖宮產術中的肌層組織中也檢測到［3］。本文探討GPR30與子宮肌瘤發生的相關性。

1 材料和方法

1.1 標本收集 收集2015年1月至6月寧波大學醫學院附屬醫院婦科行手術切除的子宮肌瘤組織及瘤旁子宮平滑肌組織標本30對?；颊咧形荒挲g39歲（35～46歲），月經周期規則。標本經病理證實為子宮平滑肌瘤及增生期內膜。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。排除合并有子宮內膜異位癥、惡性腫瘤、盆腔炎癥性疾病及結締組織疾病的患者。術前至少3個月內未接受過任何性激素類藥物治療。

1.2 方法 （1）免疫組織化學染色：采用卵白素標記堿性磷酸酶方法檢測GPR30蛋白在子宮肌瘤及瘤旁正常子宮平滑肌組織。使用的一抗為GPR30兔多抗（稀釋比為1∶300），購自北京博奧森公司；二抗為北京中衫金橋公司試劑盒中抗體（1∶100，試劑盒貨號為：SP-9000）。檢測按免疫組化試劑盒內說明書進行，步驟如下：常規石蠟標本3～4 μm連續切片，常規脫蠟、水化，枸櫞酸鹽緩沖液高溫、高壓抗原修復，3%過氧化氫鈍化內源性過氧化物酶活性，加山羊血清封閉后加入一抗，4℃冰箱過夜后加二抗。滴加適量的辣根酶標記鏈酶卵白素，常規二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。（2）總蛋白質提取及Western blot分析：①總蛋白質提取及定量：將切碎的冰凍組織放入適量蛋白提取液中（每100mg組織使用1ml RIPA蛋白裂解液，臨用時加入羅氏公司蛋白酶抑制劑）高速勻漿，12000g離心5min后，上清液分裝至EP管中-20℃凍存，取4μl用于BCA蛋白定量分析，具體參照上海生工生物公司BCA試劑盒說明書。使用時加入蛋白上樣緩沖液于100℃變性5min后上樣。②Western blot：制備12%SDS-PAGE凝膠，每泳道加樣量為30μg總蛋白質，200v恒壓電泳1～2h后，分離凝膠將蛋白轉印至PVDF膜上（Millipore公司，Immobilon?-P），200mA恒流冰浴電轉1.5h。脫脂牛奶封閉后加入一抗（2μg/ml）4℃封閉過夜，PBST漂洗后加入HRP標記二抗（1/4～5000）室溫孵育1h。充分洗滌后使用ECL顯影（參照ECL試劑盒說明書進行）。得到的X線膠片掃描后用ImageJ軟件分析條帶的光密度數值。以GAPDH作內參照進行定量數據處理。（3）實時熒光定量逆轉錄-PCR：①以GPR30基因CDS序列為擴增目標序列，為了保證擴增特異性DNA，所有引物設計擴過內含子區域。經NCBI blast驗證其特異性。引物由上海生工生物工程公司合成。選用GAPDH作內參照用于確保實驗準確性和后期定量分析。用于檢測GPR 30mRNA表達水平的上下游引物序列分別為：5'-GGGCCACGTCATGTCTCTAA-3'，以 及：5'-CTGGTCGACGGTGTCAGAAA-3'， 產 物大小為270bp。作為內參用的GAPDH上下游引物分 別 為：5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'以 及5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'，產物大小為168bp，橫跨3號和4號外顯子。②總RNA提取及cDNA合成：用Invitrogen公司的Trizol試劑從冰凍組織中提取總RNA，RNA濃度用分光廣度計測量后取1μg RNA按上海生工逆轉錄試劑盒合成cDNA。循環條件是：42℃15min；99℃5min。③實時熒光定量逆轉錄-PCR：相對實時熒光定量PCR根據Eco實時熒光定量PCR的指導手冊完成。每孔總體積為25μl，其中含有12.5μl 2×SybrGreen Master Mix試劑混合液，0.375μl稀釋熒光帶，上、下游引物分別為1μl（150nM），8μlDEPC水及2.5μl cDNA。相對實時熒光定量PCR擴增效率根據△CT值計算，在90%～110%范圍內被認為有效。用DEPC水作為陰性對照。用熔解曲線來監測實驗結果是否有引物二聚體產生。循環體系為：95℃30s；55℃60s；72℃60s。熔解曲線條件為55℃～95℃。用瓊脂糖凝膠電泳進一步確認PCR產物擴增片段。GPR30基因相對表達率根據Pfaff方法計算，采用正常子宮平滑肌組織cDNA做為標準值（Calibrator）。采用HPRT-1基因作為內參照（GAPDH基因作為內參照得到同樣結果）。平均CT值轉換成倍數關系進行圖表分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS Windows 18.1統計軟件。計量資料以（x±s）表示，用配對t檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色 結果顯示GPR30蛋白在子宮肌瘤及瘤旁正常子宮肌組織中均有較豐富的表達。GPR30主要分布在胞漿內（見圖1）。

圖1 GPR30在子宮肌瘤和瘤旁肌層組織中的免疫組化染色

2.2 Western blot GPR30蛋白的表達在增生期的子宮肌瘤組織中的表達均明顯高于瘤旁正常子宮平滑肌層組織（子宮肌瘤組：2.69±1.06；正常肌層組：1.76±0.85，P＜0.05）（見圖 2）。

2.3 實時熒光定量PCR 結果顯示GPR30 mRNA的表達在增生期的子宮肌瘤細胞中的表達均明顯高于瘤旁正常子宮肌細胞（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 GPR30 mRNA在肌瘤和瘤旁肌層組織中的表達

3 討論

3.1 GPR30的由來和定位 上世紀90年代，Cameci等［4］發現G蛋白偶聯受體30（GPR30），其有別于傳統雌激素受體，在2008年正式被命名為G蛋白偶聯雌激素受體（GPER）。以往認為作為GPR30只在細胞膜上表達，然而越來越多的研究認為GPR30主要分布于細胞的內質網上，在胞漿中也有表達。也有學者提出GPR30在雌激素刺激下可出現從胞膜到胞核的轉位［5］。ERα本是核受體，但在雌激素刺激下也可在胞核與胞膜之間穿梭［5］。本研究通過免疫組化檢測提示GPR30主要存在于胞漿中，而非細胞膜上。但近來有學者通過免疫組化檢測提示GPR30主要存在于胞核上［6］，與本研究不一致。各實驗室所用細胞特異性、功能狀態和抗體不同都有可能影響實驗結果。因此，還需進一步研究確定GPR30的具體亞細胞定位。

3.2 GPR30在組織中的表達 Beth［7］等發現子宮內膜異位癥的在位及異位內膜中GPR30的表達均高于正常內膜組織。正常內膜中GPR30表達受雌孕激素周期性調節影響，但在子宮內膜異位癥中的在位及異位內膜中表達卻是失控的。也有研究發現在人類的內膜及早孕期蛻膜組織中GPR30的表達在分泌期低于增殖期，尤其低于早孕期蛻膜，表達模式可能受卵巢激素的調節［8］。在乳腺癌、子宮內膜癌細胞中發現GPR30呈高表達，提示其可能與疾病的發生有關。GPR30還可能參與孕期人類子宮肌層的生理活動，在老鼠的子宮肌層中也檢測到GPR30 mRNA。結合本試驗，作者推測GPR30在子宮肌瘤細胞的局部高表達與子宮肌瘤的發生可能有相關性。作者發現在子宮肌瘤及瘤旁子宮平滑肌層組織中GPR30均有表達。通過檢測GPR30 mRNA及其蛋白水平，發現在增生期的子宮肌瘤組織中GPR30表達均明顯高于瘤旁子宮平滑肌組織。子宮肌瘤并非彌漫性病變，可能與局部高水平雌激素有關，其與GPR30高表達也有一定相關性。

3.3 GPR30可能參與的信號通路 選擇性雌激素受體調節劑（SERM）他莫昔芬及其代謝產物4羥基他莫昔芬和純抗雌激素藥物氟維司群（ICI182780）都能與GPR30結合。這些合成的抗雌激素藥物是雌激素核受體α完全或不完全的拮抗劑，卻是GPR30的激動劑，這可能與上述藥物的耐藥性有關。Vivacqua等［7］發現在甲狀腺癌及子宮內膜癌細胞系中4羥他莫昔芬拮抗ERα活性，但同時又可通過GPR30來誘導c-fos表達和細胞增殖，這或許可以解釋乳腺癌內分泌治療增加子宮內膜增生和癌變風險的現象。GPR30能與雌二醇或環境雌激素特異性結合，且又不受經典雌激素拮抗劑阻斷。通過酶和細胞膜離子通道相關的細胞膜上雌激素受體激活，經GPR30介導的快速傳輸途徑，被稱為“非基因組”信號途徑［9］。與雌激素類物質結合的GPR30快速激活細胞內的第二信號系統，包括胞內磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）的激活、鈣離子動員和環磷酸腺苷（cAMP）的產生等，間接調解產生一系列基因轉錄反應，在細胞中發揮多種類型生物學效應［10］。這是一個錯綜復雜的信號轉導網絡，不僅在每條通路上有許多精細的調節，而且各通路之間也存在著極其復雜的相互聯系。故可以進一步探索GPR30在子宮肌瘤細胞上的雌激素信號傳導機制，在通路中尋找抑制肌瘤細胞周期活動和增殖的位點，為研究子宮肌瘤的治療和預防尋找新靶點。本資料提示：在子宮平滑肌組織及子宮肌瘤組織中均檢測到GPR30，且二者有明顯的表達差異。因此，可以認為針對GPR30表達呈陽性的子宮肌瘤患者輔助應用相應拮抗劑，可能有助于提高子宮肌瘤治療的效果及預防復發，為該疾病的治療帶來新的機遇。