日糧因素對反芻動物胰腺外分泌功能的調控

■姚軍虎 郭 龍 曹陽春

（西北農林科技大學，陜西楊凌712100）

胰腺外分泌對日糧中營養物質在反芻動物小腸內的消化十分重要。胰腺外分泌部由分泌胰液的腺泡和運輸胰液的胰腺管組成，能合成和分泌胰淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和糜蛋白酶等消化酶，能夠消化過瘤胃的淀粉、脂肪和蛋白質等營養物質。國內外研究中，以胰腺淀粉酶的分泌調控居多，因為反芻動物小腸內過瘤胃淀粉的消化受到胰腺外分泌功能的限制[1-2]，約有40%的過瘤胃淀粉不能被消化利用[3]，造成能量利用效率偏低。所以提高反芻動物胰腺外分泌能力，尤其是淀粉酶的分泌，是提高能量利用效率的關鍵[4]。

1 反芻動物胰腺的生理結構

胰腺作為化學性消化腺體，由分泌胰島素和胰高血糖素等激素的內分泌部和分泌淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶的外分泌部組成，在動物正常生長發育、繁殖和生產過程中發揮重要的作用。奶牛對淀粉等日糧營養物質的消化主要依賴瘤胃的微生物消化，腸道內的化學性消化則與單胃動物相似，主要依賴胰腺分泌的消化酶。認識反芻動物胰腺的生理結構及分泌消化酶的主要細胞類型——腺泡細胞，是進行胰腺外分泌功能的調控研究的基礎。

1.1 胰腺的生理結構

胰腺在奶牛體內位于腹膜后，呈長條狀，分為頭、頸、體、尾4種結構，但各結構間并無明顯界限。胰腺表面被薄層結締組織所覆蓋，被十二指腸環繞。胰腺按照功能分為內分泌部和外分泌部。胰腺外分泌部分呈多分支小葉狀，包含分泌胰酶的腺泡和分泌水、電解質并具有運輸通道作用的導管。胰液由碳酸氫鈉等無機鹽、淀粉酶、蛋白酶等酶原顆粒和水構成，通過導管流入十二指腸內，消化食糜中的淀粉、蛋白質和脂肪等物質。胰腺內分泌部分呈緊密球團狀，嵌于外分泌部分，由胰島細胞構成。胰島細胞分為四類，包括α細胞、β細胞、δ細胞和PP細胞，分別分泌升高血糖的胰高血糖素、降低血糖的胰島素、生長抑素（以旁分泌的方式抑制α、β細胞）和胰多肽（抑制胃腸運動、胰液分泌和膽囊收縮）。內分泌細胞只占胰腺細胞總數的極少部分[5]，但分泌的激素卻有十分重要的調節功能，尤其是在血糖平衡方面。

1.2 胰腺腺泡細胞

胰腺組織中，80%的細胞是腺泡細胞。腺泡是胰腺行使外分泌功能的基本功能結構，由錐形的漿液性腺細胞組成，主要用于合成、儲存和分泌各種消化酶。腺泡細胞是典型的分泌型細胞，其結構如1 圖所示。大量的酶原顆粒分布于細胞基部，蘇木精染色呈嗜酸性，顆粒數量隨功能和狀態而變化。酶原顆粒旁邊有許多核糖體和內質網等細胞器，呈嗜堿性，細胞核呈橢圓形，位于細胞中部偏上。內質網核糖體合成蛋白質，運輸到高爾基體加工后形成酶原分泌顆粒，腺泡細胞以胞吐的方式將酶原顆粒釋放到腺泡腔，再經過胰腺導管進入十二指腸，被腸激酶活化后發揮營養物質消化的作用。本課題組成功分離并培養了奶牛胰腺腺泡細胞，并以此為模型，研究了功能性氨基酸對消化酶分泌的影響和機理。

圖1 胰腺腺泡細胞的結構示意圖[6]

2 反芻動物對碳水化合物的消化過程

反芻動物瘤胃內存在大量的細菌、原蟲和厭氧真菌，盡管沒有消化腺體，但可依靠這些種類和數量龐大的微生物發酵和降解攝入的飼料。皺胃具有消化腺體，能夠分泌消化液，但是消化能力有限。反芻動物，特別是奶牛，瘤胃內碳水化合物的消化代謝調控研究的較為透徹，目前，單純調控瘤胃的消化代謝并不能繼續提高動物的生產性能。小腸內的化學性消化逐漸受到重視，其消化生理的研究圍繞胰腺功能、小腸酶分泌、小腸微生物、小腸葡萄糖轉運載體以及小腸屏障功能等的作用及其調控。反芻動物可高效的利用蛋白類和脂肪類飼料進行生長、生產、繁殖等[7]。

奶牛日糧中的纖維素和半纖維素在瘤胃內由微生物產生的纖維素酶降解，分別產生葡萄糖和戊糖，進而生成丙酮酸和揮發性脂肪酸（VFA），瘤胃微生物不能消化木質素。淀粉等非結構性碳水化合物被瘤胃微生物發酵產生乙酸、丙酸、丁酸等VFA，經瘤胃壁吸收后為奶牛提供能量，同時被微生物自身利用產生甲烷，損失能量[8]，降低能量利用效率。微生物發酵產熱時也會消耗能量。研究發現，瘤胃微生物發酵淀粉產熱的能量損失約為日糧消化能的3%～12%[9]。瘤胃內保持一定比例的淀粉發酵，有利于反芻動物瘤胃能氮平衡，獲得更高的微生物產量。

圖2 淀粉在反芻動物小腸內的消化吸收過程

淀粉類飼料是日糧中主要為奶牛提供能量的營養成分，大部分在瘤胃中被微生物發酵生成VFA被瘤胃壁吸收，在肝臟內合成葡萄糖或在乳腺內合成乳脂。小腸內的消化過程，反芻動物與單胃動物相似，具體的消化過程如圖2 所示，需要經歷以下三個過程：①在淀粉酶的作用下淀粉被水解成小分子低聚糖；②在α糖水解酶的作用下，低聚糖被分解為葡萄糖；③葡萄糖轉運載體將腸腔中的葡萄糖轉運到小腸上皮細胞內[10]。由此看出，淀粉在小腸內的消化起始于胰腺腺泡細胞分泌的淀粉酶[11]，淀粉酶在腸腔中被活化，切斷α-1，4 糖苷鍵，將淀粉分解成葡萄糖分子或小分子低聚糖（如麥芽糖、麥芽三糖等）從而被腸上皮細胞吸收，為機體供能。真胃灌注淀粉比瘤胃提供的代謝能轉化為組織能量的效率高25%[12]。小腸淀粉消化過程中沒有發酵產熱，但在消化酶的作用下，糖苷鍵斷裂也釋放熱能，Baldwina 等[13]估計淀粉在小腸消化中釋放的熱量相當于日糧消化能的0.6%，遠遠小于瘤胃中的能量損失。

反芻動物攝入的淀粉中有15%～25%不經瘤胃消化進入小腸[4]。盡管理論上淀粉可在小腸內被消化，并以葡萄糖的形式被高效吸收、直接供能，效率遠高于瘤胃內微生物降解產生VFA 吸收到體內被合成葡萄糖等能量物質的效率，但反芻動物小腸淀粉消化能力有限，僅能夠消化40%～62%的過瘤胃淀粉[1]，限制了淀粉在小腸中的消化利用。提高日糧淀粉水平雖短期內可增加奶牛的有效能供應和生產性能，但過高的瘤胃可發酵淀粉往往誘發各種代謝性疾病，如瘤胃酸中毒。同時，過多的過瘤胃淀粉卻因胰腺淀粉酶分泌不足[10]而難以在小腸中被完全消化，降低日糧能量效率甚至引起后消化道酸中毒。因此，改善反芻動物胰腺淀粉酶的分泌能力成為提高小腸淀粉消化的關鍵。

3 胰腺外分泌功能的影響因素

胰腺消化酶的分泌在營養物質的攝入和消化時啟動，同時受到多種因素影響，例如動物年齡、神經和體液、日糧組分等。

3.1 動物年齡

隨著日齡的增加，動物胰腺的發育逐漸成熟，分泌胰液的總量及其內含有的消化酶的量提高[14]。新生犢牛小腸內容物中的消化酶包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力都很低，60日齡時，這些酶活力顯著提高，淀粉酶活力比初生時約高40倍[15]。胰液總量的分泌情況與之類似，4 日齡犢牛分泌胰液的流量僅為100 日齡犢牛的1/6[16]。

3.2 神經和體液

中樞神經系統通過迷走神經調控胰腺分泌功能。阻斷迷走神經后，降低犢牛胰液的分泌量、胰蛋白酶的活性和胰液中蛋白質的濃度[17-18]。此外，刺激膽堿能神經可使胰腺外分泌增加，且提高內源性胰泌素和膽囊收縮素的分泌。這些試驗結果說明神經在調節胰腺的外分泌功能中具有十分重要的作用。

膽囊收縮素（cholecystokinin, CCK）已被證實是調控胰酶釋放的重要腦-腸肽。CCK 由腸內黏膜I 型細胞在受到氨基酸和脂肪酸的刺激時產生和分泌。CCK通過兩種方式調控胰腺外分泌功能：①直接作用于腺泡細胞膜表面受體[19]，此過程會受CCK頡頏劑影響(阿托品除外)；②與膽堿能神經元調節器互作，調控胰腺腺泡細胞的分泌能力。CCK 受體有CCK1 和CCK2兩個亞型，均屬于G蛋白偶聯受體家族[20-21]。對犢牛進行CCK受體定位，發現這兩種受體均在胰腺中表達[22]，但成年后胰腺內的CCK受體主要為CCK2，且主要分布于胰島細胞及導管細胞膜表面，而腺泡細胞膜并沒有這兩種受體的表達。主要是因為隨著犢牛的發育，胰腺功能出現轉化和退化，喪失一些功能。此外，免疫熒光試驗的抗體選擇和成像方法，對試驗結果的影響也不容忽視。CCK 還能夠促進小鼠胰腺的發育，表現為提高胰腺重量、腺泡細胞體積、胞內核酸和蛋白質的含量[23]。CCK 的體循環水平影響小鼠胰腺酶基因的表達[24]。在反芻動物上的研究發現，當用CCK類似物（如蛙皮素）孵育牛胰腺組織時，會直接影響胰腺外分泌功能，這種影響具有動態性且只出現在經過大量灌注過瘤胃蛋白質的牛的胰腺組織上[25]。在苯丙氨酸和CCK 互作促進奶牛胰腺腺泡細胞消化酶分泌的試驗中，我們也觀測到CCK對腺泡細胞分泌能力的直接影響。

胰島素是胰島β細胞分泌的激素，能調節機體的血糖濃度，并作為信號分子參與機體其他的生理代謝過程，如促進mTOR信號通路調控蛋白質的合成。胰島素調控血糖濃度是通過促進組織細胞攝取和利用葡萄糖，并抑制糖原分解和糖異生過程來實現的。胰島素調控單胃動物和反芻動物胰腺外分泌功能的作用可能存在差異。胰島素能改善糖尿病小鼠胰腺的外分泌功能[26]，但是奶山羊十二指腸灌注亮氨酸后胰腺α-淀粉酶mRNA 表達的調控不依賴于血清胰島素的變化[27]。

3.3 日糧因素

3.3.1 碳水化合物

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日糧碳水化合物的比例和類型影響胰腺的外分泌功能，尤其是淀粉酶的分泌。綿羊飼喂以粉碎玉米為基礎的日糧時較飼喂干草提高了胰腺淀粉酶的濃度和活力[28]。同時，研究發現奶山羊小腸干物質和淀粉消化率分別與食糜淀粉酶存在顯著的線性關系（圖3），說明淀粉酶在碳水化合物和干物質消化中具有重要作用[29]。由表1 可知，奶山羊飼喂淀粉含量分別為25%、35%和45%的等蛋白質日糧時，高淀粉含量組（45%淀粉組）的胰腺淀粉酶活力顯著高于25%淀粉組[30]。也有研究表明，單純增加過瘤胃淀粉并不能夠改善反芻動物胰腺的外分泌功能或影響效果會隨時間及劑量效應而消失。荷斯坦閹牛皺胃灌注水解淀粉（20、34.2 g/h 和40 g/h）時降低了α-淀粉酶濃度及分泌速率[31-32]。奶山羊胰腺淀粉酶分泌隨著過瘤胃淀粉的增加逐漸增加，在102 g/d達到峰值，隨后也出現了下降[33]。這些結果說明小腸碳水化合物的含量影響淀粉酶的分泌，但是這些或正向或負向的效應是由腸腔中碳水化合物的增多還是吸收的葡萄糖濃度升高而引起的，目前還不得而知。因此，通過增加過瘤胃淀粉含量的方法提高小腸內淀粉的消化率目前還并不能夠取得理想的效果，應該探索其他的營養策略例如調整日糧氨基酸比例和蛋白含量，調節激素（胰島素）的分泌等。

圖3 山羊小腸食糜淀粉酶活力與日糧干物質（A）和淀粉（B）小腸消化率間的關系[29]

表1 飼喂不同比例淀粉對山羊胰腺淀粉酶活力的影響

3.3.2 氨基酸（蛋白質）

功能性氨基酸尤其是亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，在刺激反芻動物消化酶分泌的試驗中已經表現出顯著的結果。

奶山羊十二指腸連續灌注亮氨酸14 d 后，線性增加了淀粉酶的活力，但并不影響總蛋白質輸出、脂肪酶和胰蛋白酶分泌及血漿胰島素濃度；胰液和淀粉酶分泌符合二次曲線的規律，最高值出現在亮氨酸灌注3 g/d 和6 g/d；奶山羊十二指腸亮氨酸灌注劑量和時間顯著影響了胰酶的分泌，但是不影響血漿胰島素的濃度[27]。十二指腸灌注亮氨酸也能夠顯著調控奶山羊胰腺的發育和胰酶基因的表達，對反芻動物腸道內淀粉等營養物質的消化具有重要作用[34]。Liu 等[35]利用4 頭荷斯坦青年牛[（215±7）kg]進行胰腺插管及十二指腸瘺管，灌注不同濃度的亮氨酸，結果發現10 g 亮氨酸顯著提高了胰液的分泌、淀粉酶的濃度和分泌速率。荷斯坦奶公犢牛飼喂原奶中添加亮氨酸，發現胰腺蛋白質的濃度（mg/kg BDW）顯著的增加了，但是并沒有影響淀粉酶的分泌[36]，血清葡萄糖，必需氨基酸、8 周齡體軀指數和平均日增重均顯著提高[37]。亮氨酸可以作為營養信號刺激淀粉酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶的分泌，且亮氨酸的這些功能有劑量和時間依賴性。

異亮氨酸和亮氨酸同屬支鏈氨基酸，在分子結構和功能上與亮氨酸類似[38]。荷斯坦青年奶牛十二指腸連續灌注試驗表明，灌注異亮氨酸10 h 時，胰液的分泌量和pH 值沒有受到影響，但是胰液中蛋白質濃度（mg/ml）、胰液分泌速率（mg/h）、淀粉酶活力、胰蛋白酶活力在20 g 和30 g 異亮氨酸灌注組顯著提高，且符合線性規律，糜蛋白酶和脂肪酶活力不受異亮氨酸灌注量的影響（表2）；灌注異亮氨酸10 d 后，胰腺總蛋白分泌量、胰蛋白酶分泌濃度和分泌速率與異亮氨酸灌注濃度成線性正相關，胰液總蛋白濃度和分泌速率、淀粉酶活性顯著提高，糜蛋白酶和脂肪酶活力不受影響（表3）[39]。在體外孵育奶山羊胰腺組織的試驗中，我們發現異亮氨酸通過提高4EBP1γ的磷酸化程度，降低eEF2 的磷酸化水平提高淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的組織濃度、緩沖液釋放濃度。

苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，有研究表明可以通過CCK 途徑調控胰腺的外分泌[40]。奶山羊十二指腸連續灌注苯丙氨酸14 d的試驗發現，奶山羊胰膽汁分泌量、淀粉酶分泌量和血清CCK 濃度隨苯丙氨酸灌注量的增加呈現先增加后下降的二次曲線變化，在2 g/d 苯丙氨酸時有最大值；胰蛋白酶分泌也呈二次曲線變化，最大值出現在4 g/d；脂肪酶分泌受苯丙氨酸影響顯著降低[41]。奶公犢飼喂原奶中添加亮氨酸和苯丙氨酸對小腸食糜α-淀粉酶（表4）活力無顯著影響(P＞0.05)，但小腸各位點食糜內淀粉酶活力有顯著差異(P＜0.05)，各處理和小腸相對位點間存在交互作用的趨勢(P=0.054)；亮氨酸和苯丙氨酸處理組小腸α-淀粉酶從0%到100%位點，呈先下降再上升的變化趨勢；苯丙氨酸對奶公犢小腸食糜胰蛋白酶活力無顯著影響(P＞0.05)，相對位點不同顯著影響胰蛋白酶活力(P＜0.05)（表5）[36-37]。此外，體外試驗表明，苯丙氨酸顯著提高奶牛胰腺組織淀粉酶、胰蛋白酶的合成、分泌及mRNA表達[42]。

表2 十二指腸灌注異亮氨酸10 h對奶牛胰腺外分泌的影響

表3 十二指腸灌注異亮氨酸10 d對奶牛胰腺外分泌的影響

4 胰腺外分泌調控的機理

本課題組以奶公犢牛原代胰腺腺泡細胞為試驗模型，對其外分泌的調控機理進行了研究，發現胞內鈣離子、蛋白酶體及相關信號傳導途徑等構成的復雜調控網絡是胰腺腺泡消化酶合成和分泌的關鍵。

4.1 胞內鈣離子信號

表4 原奶中添加亮氨酸和苯丙氨酸對奶公犢小腸食糜α-淀粉酶活力的影響

表5 原奶中添加亮氨酸和苯丙氨酸對奶公犢小腸食糜胰蛋白酶活力的影響

鈣離子在腺泡細胞主要儲存于內質網。在細胞質內，鈣離子則發揮由刺激到分泌的偶聯中心的作用。當細胞內CCK 或乙酰膽堿類激素達到生理刺激濃度時，細胞便會產生IP3和煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide Phos Phate,NAADP）這兩種第二信使，當它們與位于內質網上的利阿諾定受體（ryanodine recePtors，RyRs）和三磷酸肌醇受體（inositol 1,4,5-tris Phos Phate receptor，IP3R）結合后，會釋放儲存于內質網的鈣離子，使細胞質內的鈣離子濃度出現小幅度震蕩，從而提高酶原顆粒從胞內到胞外的釋放[47-48]。

4.2 蛋白酶體活性

蛋白酶體是細胞內重要的蛋白質復合體，起降解細胞內蛋白質的功能[49]。一些研究表明，在小鼠胰腺中，26S 蛋白酶體的亞基抗分泌因子（anti-factor 4）能夠顯著調控消化酶的分泌[50]。超生理濃度的亮氨酸（1.35 mmol/l）顯著抑制蛋白酶體的活性，降低了奶牛胰腺腺泡細胞淀粉酶的分泌，通過使用蛋白酶體的特異性抑制劑MG132 后，發現蛋白酶體在該腺泡細胞中，對淀粉酶分泌起到重要的作用[51]。此外，本課題組通過Label-free 蛋白質組學分析方法，也發現亮氨酸顯著影響了腺泡細胞內蛋白酶體相關蛋白亞基的表達。此外，在胰腺β型細胞中，胰島素分泌受到蛋白酶體活性的影響[52]。泛素-蛋白酶體是細胞生命進程的重要調節方式，在疾病模型細胞內的功能和作用受到了廣泛的關注，但是對于蛋白質代謝活動旺盛的分泌型細胞，還需要進一步研究。

4.3 分子信號途徑

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號（mammals target of rapamycin, mTOR），其上游的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3，PI3K）信號及一般氨基酸調控阻遏蛋白2（generalamino acid control non-derepressible 2, GCN2）信號通路構成的分子信號網絡主要調控腺泡細胞內氨基酸依賴的蛋白質合成過程[53]。mTOR 信號通路是調控細胞內蛋白質合成和降解、細胞生長和增殖的中心[54]。亮氨酸[55]和苯丙氨酸[42]能夠分別激活Akt-mTOR 和S6K1，提高翻譯起始復合物的形成而增加消化酶的合成。異亮氨酸也能夠使mTOR 信號通路因子磷酸化，提高蛋白質合成的效率。氨基酸調控腺泡細胞內蛋白質周轉和代謝的信號傳導途徑，已經有詳細綜述[56]，具體調控網絡見圖4。

一般分泌型（SEC）信號通路是調控蛋白質運輸的信號通路，而且廣泛存在于各類型細胞中[57]。調控SEC系統的關鍵蛋白復合物，原核生物中是SEC YEG通道蛋白，真核生物中則是SEC61復合物[58]。我們發現，奶公犢腺泡細胞內高濃度的ATP，不僅能夠供給蛋白質內質網加工的能量，提高蛋白質的合成，同時能夠刺激SEC信號通路活化，促進酶蛋白從胞內釋放到胞外，提高胰酶的分泌。氨基酸，尤其是亮氨酸介導的ATP增加，主要是依賴三羧酸循環和氧化磷酸化中關鍵酶活力的增加，如檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和細胞色素氧化酶等。

圖4 氨基酸調控奶牛胰腺腺泡細胞消化酶分泌的信號傳導網絡

5 結語

反芻動物，尤其是奶牛，胰腺分泌淀粉酶不足是造成小腸淀粉消化率低的關鍵因素。理論上小腸內葡萄糖形式的供能效率優于瘤胃內揮發性脂肪酸的供能效率，在奶牛泌乳初期采食量低的情況下，泌乳需要大量能量供應，此時若以小腸供能為主要方式不僅可以提高奶牛的泌乳性能，也能夠保證奶牛的健康。因此，通過營養手段提高胰腺外分泌能力，不僅可以解決奶牛能量供應問題，也可提高生產性能，促進機體健康，提高飼料效率，降低養殖過程中對環境的污染，促進奶業的可持續發展。

我們應注意到，奶牛等反芻動物的胰腺外分泌能力受眾多因素影響，雖然應用改變日糧碳水化合物結構和單一功能性氨基酸的添加等方法取得了一定的效果，但是，氨基酸的平衡性及功能性氨基酸整合的作用還需要進一步研究。日糧外源消化酶的添加也能夠提高腸道營養物質的消化，但酶的種類、數量等基礎指標還需要進一步確定。腸道微生物在營養物質的消化過程中也具有重要的作用，我們不能忽視這些微生物的作用，對于微生物在腸道內的定植、代謝需要深入研究。