西歸揮發油抗痛經作用研究

邱 艷，陳 蓮，劉建霞，郭美仙，劉曉波

（大理大學藥學與化學學院，云南，大理 671000）

痛引腰骶或周期性小腹疼痛是經期或經期前后婦女常見的痛經表現，痛經嚴重時會導致昏厥。根據有無盆腔器質性病變，痛經可分為原發性痛經和繼發性痛經[1]。據報道，約有30%～80%的青春期女性發生痛經，13.6%極大地影響正常生活和工作[2]。目前，原發性痛經的病因尚不明確，體內的雌激素、縮宮素、前列腺素、血管加壓素等因子水平改變是現代醫學普遍認為的原因。中醫證型最多見的是氣滯血瘀和寒濕凝滯[3]。西醫臨床治療藥物有：非甾體抗炎藥、鈣離子拮抗藥、β-受體激動藥[4]。但這些藥物均有不同程度的不良反應和臨床應用局限性，且有文獻報道常規治療約有 20%～25%的患者無效[5]。中醫治療痛經不僅方法多樣且副作用少，有明顯的優勢，因此研制預防和治療痛經不同證型的系列中藥顯得意義重大。

西歸，為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹（Vicatiathibetica deboiss）的根[6]。它是典型的白族藥材，民間用于胃寒痛、腎虛腰痛、痰涎、風濕等疾病的治療，也可作為滋補菜蔬食用，其風味獨特[7]。目前研究表明西歸提取物具有抗疲勞[8-9]、抗氧化[10]、調節免疫[11-12]、助消化[13]等作用。西歸在治療痛經方面也有潛在價值[14]，但西歸揮發油抗痛經作用尚不清楚。本研究通過離體子宮實驗、在體動物實驗，探索西歸揮發油抗痛經作用，為研制具有抗痛經作用的中藥提供基礎研究資料。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雌性未妊娠KM小鼠，體重18～22 g；健康雌性未妊娠SD大鼠，體重180～220 g，均由湖南斯萊達景實驗動物有限公司提供，生產許可證均為SYXK(湘) 2016-0002。

1.2 實驗藥物

西歸，生藥采自云南省大理州鶴慶縣馬廠鄉，由大理大學藥學與化學學院生藥教研室楊月娥高級實驗師鑒定為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹的干燥根；西歸揮發油（自制）；石油醚（購于云南省大理州博源化工）；痛經寶顆粒（仲景宛西制藥股份有限公司，批號：161202）；己烯雌酚注射液2 mg/mL （上海第九制藥廠，批號960405）；縮宮素注射液10 U/mL（上海禾豐制藥有限公司，批號：09170102）；苯甲酸雌二醇注射液4 mg/2mL（吉林省華牧動物保健品有限公司，批號：170213）；吐溫-80（上海大眾制藥廠，批號：910418）。

1.3 儀器

旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，RE52- 05）；張力換能器（北京航天藥學工程研究所）；恒溫水浴鍋（上海市實驗儀器廠）；BL-420F 生物機能實驗系統（上海益聯科教設備有限公司）；HW-400 恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，AE200) 。

2 方法

2.1 西歸揮發油的提?。ɑ亓魈崛》ǎ?/h3>

將西歸研碎，取粉末300 g，置于5 L圓底燒瓶中，按1:5比例加入適量的石油醚（1500 mL）浸泡過夜，回流提取3 h（溫度55～60 ℃），得到黃褐色透明油狀混合物。將餾出液至旋轉蒸發儀，回收石油醚（溫度 30～60 ℃），當餾到少量時，放到水浴鍋（溫度50～55 ℃）讓石油醚揮干，得到無石油醚味只具有濃郁中藥香味的黑褐色油狀物即為西歸揮發油，收集揮發油密封保存并稱重，得1.56 g揮發油，計算其產率為：0.52 g/100 g。將提取好的西歸揮發油用1%吐溫-80助溶，配制成0.2、0.1、0.05、0.0256、0.0128、0.0064 g/mL 6個濃度的溶液。

2.2 離體痛經模型的制備[14-15]

2.2.1 正常離體子宮平滑肌標本的制作

在實驗前 45 h，每只大鼠肌肉注射己烯雌酚 0.5 mL，使動物的子宮受體密度增加，提高子宮對藥物的敏感性。實驗時處死大鼠，迅速剖取子宮，去除子宮壁上的結締組織和脂肪，將子宮迅速放入裝有洛氏液的培養皿中。用手術剪剪成2 cm制成子宮標本。將制備好的子宮標本，一端穿線固定在通氣鉤上，另一端用蛙心夾夾住，并連接張力換能器及BL-420F系統，置于盛有19 mL、32 ℃洛氏液的恒溫平滑肌槽中，向肌槽中通入連續穩定的氣泡（1～2氣泡/s），給予2 g負荷張力，待子宮平滑肌平衡后，記錄給藥前10 min 內正常離體子宮平滑肌自發收縮的收縮曲線；分別向肌槽中加入32 ℃的1 %吐溫-80溶液1 mL，記錄10 min 內正常離體子宮平滑肌在溶劑中的自發收縮的收縮曲線；之后分別向給藥筒中加入32 ℃的6個不同濃度西歸揮發油溶液，使之在肌槽中終質量濃度分別為 0.2、0.1、0.05、0.0256、0.0128、0.0064 g/mL，記錄給藥后10 min離體子宮平滑肌的運動曲線。統計分析子宮平滑肌收縮曲線的頻率、振幅、峰面積、持續時間。2.2.2 縮宮素誘導離體痛經模型的制備

按上述方法，將制備好的子宮標本分別置于盛有19 mL 32 ℃洛氏液恒溫平滑肌槽中，向每個肌槽中通入連續穩定的氣泡（1～2 氣泡/ s），給予2 g負荷張力。待子宮平滑肌的自發收縮平穩后，記錄給藥前10 min正常離體子宮平滑肌的收縮曲線；向肌槽中加32 ℃、0.1 U/mL的縮宮素100 μL，記錄加縮宮素后10 min子宮平滑肌的收縮曲線；分別向給藥筒中加入32 ℃ 3個不同濃度的西歸揮發油溶液，使之在肌槽中終質量濃度分別為0.2、0.1、0.05 g/mL，記錄給藥后10 min內離體子宮平滑肌的收縮曲線。統計分析離體子宮平滑肌收縮曲線的頻率、振幅、峰面積、持續時間。

2.3 在體痛經模型的制備[16-17]

2.3.1 苯甲酸雌二醇與縮宮素聯用制備大鼠痛經模型

取體重180～ 220 g的健康雌性未妊娠SD大鼠60 只，稱重后隨機分為6 組，每組10只；分別為正常對照組，模型對照組，痛經寶顆粒組（2.0 g/kg），西歸揮發油高、中、低（3.0、1.5、0.75 g/kg）劑量組。除正常對照組外，其余各組大鼠每天皮下注射苯甲酸雌二醇注射液1次，連續注射10 d，第1 d、第10 d每只皮下給藥劑量為2.5 mg/kg，余日每只劑量均為1.25 mg/kg。從注射苯甲酸雌二醇的第8 d起，各組分別灌胃給予相應藥物，每天兩次連續給藥3 d。末次注射苯甲酸雌二醇間隔40 h，且末次灌胃給藥1 h后，各組大鼠均按劑量10 U/kg腹腔注入縮宮素，制成大鼠痛經模型。

觀察各組大鼠的毛色，毛發光澤度，精神狀態，活躍性，對外界環境刺激的反應記下注射縮宮素后30 min內出現扭體反應的潛伏期（注：不發生扭體反應的潛伏期按30 min計）和扭體反應（腹部內凹、伸展后肢、臀部抬高）次數[18-19]，并計算扭體發生率和抑制率。

扭體發生率（%）=發生扭體動物數/總實驗動物數×100%

抑制率（%）=(模型組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數)/模型組扭體次數均值×100 %[20]。

觀察完扭體反應后，立即取出各組大鼠的子宮及卵巢，觀察子宮體積大小、子宮壁厚薄程度、卵巢體積大小的變化、子宮質量的變化。

2.3.2 苯甲酸雌二醇、冰水浴、縮宮素聯用制備小鼠寒凝血瘀型痛經模型

取體重18～22 g的健康雌性未妊娠KM小鼠60只，稱重后隨機分為6 組，每組10只；分別為正常對照組，模型對照組，痛經寶顆粒組（0.1 g/kg），西揮發油高、中、低（0.15、0.075、0.0375 g/kg）劑量組。除正常對照組外，其余各組小鼠每天皮下注射苯甲酸雌二醇注射液1次，劑量為10 mg/kg，連續注射 10 d，同時每天將小鼠置于冰水浴中10～30 min連續10 d；從注射苯甲酸雌二醇的第8 d起，各組分別灌胃給予相應藥物，連續給藥 3 d。末次注射苯甲酸雌二醇間隔40 h，且末次灌胃給藥1 h后，各組小鼠均按劑量10 U/kg腹腔注入縮宮素，制備成小鼠寒凝血瘀型痛經模型。

觀察各組小鼠的狀態，記下注射縮宮素后 30 min內出現扭體反應的潛伏期（注：不發生扭體反應的潛伏期按 30 min 計）和扭體反應（腹部內凹、伸展后肢、臀部抬高）次數，計算扭體發生率和扭體抑制率。觀察完扭體反應后，立即取出各組小鼠的子宮及卵巢，觀察子宮體積大小、子宮壁厚薄程度、卵巢體積大小的變化、子宮質量的變化。

2.4 統計分析

所有數據均以平均值±標準差表示，并應用SPSS17.0統計軟件，采用單因數方差，以P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 西歸揮發油對大鼠離體子宮的影響

3.1.1 對自發性收縮的影響

與正常組相比，吐溫-80對子宮平滑肌沒有抑制作用，故用吐溫-80作溶劑不影響實驗結果。與正常組、溶劑組比較，西歸揮發油溶液組的收縮頻率、振幅降低、持續時間增加，具有統計學意義（P＜ 0.05或P＜ 0.01）；0.0128、0.0064 g/mL的西歸揮發油溶液也能降低收縮曲線的峰面積，但不具有統計學意義。說明西歸揮發油各濃度均能不同程度地抑制大鼠離體子宮的收縮，且 0.2、0.1、0.05、0.0256 g/mL的西歸揮發油溶液作用較明顯，結果見表1。

表1 西歸揮發油對大鼠正常離體子宮自發性收縮的影響（, n =10）Table 1 Effect of volatile oil from Xigui on spontaneous contraction of normal isolated uterus in rats

表1 西歸揮發油對大鼠正常離體子宮自發性收縮的影響（, n =10）Table 1 Effect of volatile oil from Xigui on spontaneous contraction of normal isolated uterus in rats

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01；與溶劑組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

收縮曲線分組劑量（g /mL） 頻率(次/10min) 振幅(mm) 面積(g.s) 持續時間(s)正常組-7.08 ± 0.030 6.20 ± 0.22 1411.84 ± 63.32 182.89 ± 7.12 1%吐溫-80 組-6.85 ± 0.35 6.04 ± 0.65 1389.71 ± 42.85 183.96 ± 6.30 0.0064 6.65 ± 0.38★★▲ 5.35 ± 0.79★ 1343.75 ± 70.67 188.79 ± 2.81 0.0128 6.62 ± 0.45★★▲▲ 5.15 ± 0.83★ 1330.32 ± 58.05 193.19 ± 3.40★★▲▲0.0256 4.61 ± 0.45★★▲▲ 3.09 ± 0.44★★▲▲ 1178.74 ± 106.91★★▲▲ 195.53 ± 4.46★★▲▲0.05 4.30 ± 0.50★★▲▲ 2.14 ± 0.66★★▲▲ 1149.32 ± 127.86★★▲▲ 200.94 ± 6.08★★▲▲0.1 4.06 ± 0.29★★▲▲ 2.06 ± 0.36★★▲▲ 1065.50 ± 61.85★★▲▲ 205.16 ± 4.28★★▲▲西歸揮發油0.2 6.65 ± 0.38★★▲▲ 2.81 ± 0.52★★▲▲ 1172.59 ± 141.67★★▲▲ 196.08 ± 4.15★★▲▲

3.1.2 對縮宮素誘發痙攣收縮的影響

與正常組、吐溫-80組相比，縮宮素組（模型組）子宮平滑肌收縮頻率、振幅、面積升高，持續時間明顯降低（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，西歸揮發油0.2、0.1、0.05 g/m L組子宮平滑肌收縮頻率、振幅、面積顯著降低，持續時間明顯升高，具有統計學意義（P＜0.01）。與20 %痛經寶組比較，差異無顯著性。西歸揮發油能顯著抑制縮宮素誘發的大鼠離體子宮痙攣性收縮，作用明顯，故以西歸揮發油0.2、0.1、0.05 g/mL作為高、中、低劑量組，結果見表2。西歸揮發油0.2、0.1、0.05 g/mL，痛經寶對收縮波均有較好的抑制程度，結果見圖1-4。

表2 西歸揮發油對縮宮素誘發離體子宮平滑肌痙攣收縮的影響（x ±s, n=10）Table 2 Effect of volatile oil from Xigui on the contraction of uterine smooth muscle tendon induced by oxytocin

圖1 0.05 g/mL西歸揮發油對縮宮素所致收縮波的影響Fig.1 Effect of 0.05 g/mL Xigui volatile oil on contraction wave induced by oxytocin

圖2 0.1 g/mL西歸揮發油對縮宮素所致收縮波的影響Fig.2 Effect of 0.1 g/mL Xigui volatile oil on contraction wave induced by oxytocin

圖3 0.2 g/mL西歸揮發油對縮宮素所致收縮波的影響Fig.3 Effect of 0.2 g/mL Xigui volatile oil on contraction wave induced by oxytocin

圖4 0.2 g/mL痛經寶對縮宮素所致收縮波的影響Fig.4 Effect of 0.2 g/mL Tongjingbao on contraction wave caused by oxytocin

3.2 西歸揮發油對在體痛經模型的影響

3.2.1 動物活動情況的比較

空白組大小鼠毛色又白又有光澤、雙目有神、精神充沛、活潑、反應靈敏、飲食及兩便正常。

造模大鼠毛色粗糙、目光無神、反應遲鈍、安靜、少動、喜蜷縮、喜扎堆、大小便正常、給予適當刺激反應低下；連續灌胃給藥3天高、中、低劑量的西歸揮發油和痛經寶均不同程度改善了造模大鼠出現的上述癥狀。

造模小鼠在冰水刺激后先多動、煩躁、掙扎，隨后出現寒戰、安靜、少動、喜蜷縮、喜扎堆、毛色無光澤、目光無神、目欲畢、朦朧欲睡、行動遲緩、爪尾部色紫暗、耳色暗紅、呼吸微弱、飲水量少、小便色清、大便濕爛等寒證的癥狀，對外界刺激反應低下。連續灌胃給藥3天高、中、低劑量的西歸揮發油和痛經寶后小鼠上述癥狀都有不同程度的改善。

3.2.2 對痛經大鼠扭體反應的影響

發生扭體反應的大鼠表現為腹部（子宮處）內凹，軀干與后肢伸展，臀部抬高并與一側肢體內旋，即注射縮宮素導致子宮平滑肌痙攣性收縮。與正常組相比，模型組大鼠的扭體潛伏期明顯縮短、扭體次數顯著增加(P＜ 0.01)，說明痛經模型制備成功。與模型組比較，西歸揮發油3個劑量組都能顯著延長大鼠30 min內平均潛伏期(P＜ 0.05或P＜0.01)。西歸揮發油中、低劑量組可顯著減少扭體次數(P＜ 0.05或P＜ 0.01)，西歸揮發油高劑量組也能減少大鼠的扭體次數，但不具有統計學意義。與痛經寶組比較，差異無顯著性。西歸揮發油能對縮宮素誘發的子宮痙攣性收縮所致扭體反應有較好的對抗作用，說明西歸揮發油有一定的抗痛經作用，結果見表3。

表3 西歸揮發油對縮宮素誘發大鼠扭體反應的影響（，n =10）Table 3 Effect of volatile oil from Xigui on writhing response induced by oxytocin in rats

表3 西歸揮發油對縮宮素誘發大鼠扭體反應的影響（，n =10）Table 3 Effect of volatile oil from Xigui on writhing response induced by oxytocin in rats

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組 劑量（g/kg） 扭體潛伏期(min) 30 min內扭體的次數(次) 扭體發生率(%) 扭體抑制率(%)扭體反應正常組-30.00 ± 0.00▲▲ 0.00 ± 0.00▲▲ 0 -模型組-5.91 ± 4.19★★ 25.75 ± 10.12★★ 100 -西歸揮發油 0.75 11.31 ± 3.45★★▲ 15.50 ± 7.95★★▲▲ 100 39.81 1.5 12.82 ± 5.66★★▲▲ 13.03 ± 5.07★★▲▲ 100 48.35痛經寶組 3.0 10.65 ± 4.25★★▲ 18.63 ± 8.48★★ 100 27.65 2.0 11.35 ± 3.94★★▲▲ 16.88 ± 7.59★★▲ 100 42.21

3.2.3 對寒凝血瘀型痛經小鼠扭體反應的影響

注射縮宮素后的小鼠表現為腹部（子宮處）內凹軀干與后肢伸展，臀部抬高并與一側肢體內旋，即注射縮宮素導致子宮平滑肌痙攣性收縮。與正常組相比，模型組小鼠的扭體潛伏期明顯縮短、扭體次數顯著增加（P＜0.01），說明寒凝血瘀型痛經模型制備成功。與模型組比較，西歸揮發油3個劑量組都能延長小鼠30 min內平均潛伏期、減少扭體次數，但無顯著差異。與痛經寶組比較，差異無顯著性。說明西歸揮發油能對寒凝血瘀型痛經小鼠扭體反應有一定的對抗作用，但西歸揮發油抗寒凝血瘀型痛經作用不是很明顯，結果見表4。

表4 西歸揮發油對縮宮素誘發小鼠扭體反應的影響（，n=10）Table 4 Effect of volatile oil from Xigui on writhing response induced by oxytocin

表4 西歸揮發油對縮宮素誘發小鼠扭體反應的影響（，n=10）Table 4 Effect of volatile oil from Xigui on writhing response induced by oxytocin

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組 劑量（g/kg） 扭體潛伏期(min) 30 min內扭體的次數(次) 扭體發生率(%) 扭體抑制率(%)扭體反應正常組-30.00 ± 0.00▲▲ 0.00 ± 0.00▲▲ 0 -模型組-1.56 ± 2.31★★ 36.50 ± 14.46★★ 100 -0.0375 3.07 ± 1.71★★ 28.25 ± 13.84★★ 100 22.60 0.075 3.45 ± 2.97★★ 26.88 ± 13.70★★ 100 26.36西歸揮發油0.15 3.55 ± 2.39★★ 25.38 ± 15.45★★ 100 30.47痛經寶組 0.1 4.04 ± 2.36★★▲ 22.13 ± 16.46★★ 100 39.10

3.2.4 子宮及卵巢的變化

通過對各組子宮及卵巢的觀察發現。無論是大鼠還是小鼠，與正常組相比，模型組的子宮體積顯著變大質量增加，子宮壁變薄，內膜上腺體增多，卵巢體積變大，模型組出現了明顯的病理變化，說明痛經造模成功；經灌胃給藥的西歸揮發油組以及痛經寶顆粒組子宮體積和質量變大不明顯，子宮壁稍變薄，卵巢體積沒有明顯變大，結果見表5、表6。西歸揮發油組以及痛經寶顆粒組的子宮和卵巢沒有出現明顯的病理變化，說明西歸揮發油以及痛經寶顆粒對痛經所致的病變有一定的治療和改善作用。

表5 西歸揮發油對痛經大鼠子宮變化的影響（，n=8）Table 5 Effect of volatile oil from Xigui on uterine changes in dysmenorrhea rats

表5 西歸揮發油對痛經大鼠子宮變化的影響（，n=8）Table 5 Effect of volatile oil from Xigui on uterine changes in dysmenorrhea rats

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01；與模型組比較，▲ P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

大鼠分組 劑量(g/kg) 子宮體重(g) 動物體重(g)正常組-0.4875 ± 0.1002▲▲ 204.75 ± 7.81西歸揮發油模型組-3.5038 ± 1.6763★★ 201.63 ± 5.26 0.75 1.8236 ± 0.4622★★▲▲ 207.75 ± 6.76 1.5 1.0187 ± 0.0883▲▲ 207.25 ± 7.62 3 1.0407 ± 0.1771▲▲ 205.75 ± 7.01痛經寶組 2 0.7735 ± 0.1333▲▲ 208.38 ± 6.32

表6 西歸揮發油對痛經小鼠子宮變化的影響（，n=8）Table 6 Effect of volatile oil from Xigui on uterine changes in dysmenorrhea mice

表6 西歸揮發油對痛經小鼠子宮變化的影響（，n=8）Table 6 Effect of volatile oil from Xigui on uterine changes in dysmenorrhea mice

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

小鼠分組 劑量（g/kg） 子宮體重（g) 動物體重（g）正常組-0.0509 ± 0.0180▲▲ 19.68 ± 1.93模型組-0.1260 ± 0.0420★★ 19.36 ± 1.88 0.0375 0.0966 ± 0.0169★★▲ 18.93 ± 2.50 0.075 0.0864 ± 0.0147★★▲▲ 19.16 ± 0.91西歸揮發油0.15 0.0843 ± 0.0103★★▲▲ 19.61 ± 1.14痛經寶組 0.1 0.0746 ± 0.0181★▲▲ 19.75 ± 1.25

4 討論

痛經是婦科臨床上的常見病、多發病，青年婦女尤為多見，子宮平滑肌痙攣、子宮炎癥和子宮供血不足與痛經密切相關[21]。近年來原發性痛經由于其發病率較高而備受關注。本實驗結果表明，西歸揮發油無論對正常未孕離體子宮平滑肌的自發性收縮，還是對經縮宮素處理的離體子宮平滑肌強直收縮，都可顯著降低收縮曲線的頻率、振幅、峰面積，并增加持續時間，說明西歸揮發油在抗子宮平滑肌痙攣方面有良好的治療作用，并呈劑量依賴性。本實驗針對該病主癥之“疼痛”、主要病機之“瘀”、主要病因之“氣質寒凝”而設大鼠痛經模型和小鼠寒凝血瘀型痛經模型。實驗結果顯示，西歸揮發油能明顯減少大鼠痛經模型扭體次數并延長潛伏期，對寒凝血瘀型小鼠的扭體反應也有一定的抑制作用，但作用不明顯。

我們同期的研究結果表明，西歸揮發油中含有：Z-雙氫蒿苯內酯、3-丁烯基-2-苯并（C）呋喃酮、E-雙氫蒿苯內酯、苯氧基乙酸2-丙烯脂等成分，其中Z-雙氫蒿苯內酯的含量高達70.552%。研究表明 Z-雙氫蒿苯內酯對不同平滑肌具有明顯的調節作用、鎮痛作用[22]，因此推測西歸揮發油抗痛經作用也可能與Z-雙氫蒿苯內酯有關系。但目前我們還未對西歸揮發油中的這些化學成分進行單獨的抗痛經作用測試，這將是下一步研究的目標。

綜上所述，研究結果提示，西歸揮發油具有一定的抗痛經作用，其作用機制可能與抑制子宮痙攣和調節子宮平滑肌使其興奮作用減弱相關；其抗痛經的主要成分可能是Z-雙氫蒿苯內酯。本研究為將西歸開發成有抗痛經作用的新藥提供了藥理學依據。