沃柑潰瘍病病原菌分離鑒定及防治藥劑篩選

趙洪濤　陳東奎　陳香玲　歐智濤　黃其椿　張蘭

摘要：【目的】明確廣西南寧沃柑潰瘍病病原菌種類，篩選田間能抑制該病害的藥效，為當地沃柑潰瘍病的防治提供依據?！痉椒ā坎捎媒M織分離法對病原菌進行分離和純化培養，根據柯赫氏法則進行驗證，通過形態學、16S rDNA序列分析與構建系統發育進化樹相結合的方法對病原菌進行鑒定。選用14種藥劑，采用平板對峙法測定不同藥劑對沃柑潰瘍病病原菌的室內毒力;選取室內毒力測定具有一定抑菌效果的藥劑進行田間防治效果試驗?！窘Y果】確定廣西南寧沃柑潰瘍病病原為柑桔黃單胞柑桔亞種（Xanthomonas citri subsp. citri），系A菌系。室內毒力測定結果顯示，供試的14種藥劑中只有80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑等5種藥劑對柑橘潰瘍病病原菌表現出一定的抑制效果，在500、1000、2000、4000和8000倍稀釋濃度下，80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果最好，抑菌率為77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，有效中濃度（EC50）較低，為49.09 mg/L;200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的抑菌率為73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%， EC50較高，為81.47 mg/L。田間藥效試驗結果表明，200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑和1.6%噻霉酮涂抹劑對沃柑潰瘍病有較好的防治效果，防效分別為73.45%和71.07%?！窘Y論】從廣西南寧分離出的沃柑潰瘍病病原菌為強致病性柑桔黃單胞柑桔亞種A菌系，田間可選擇200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌進行生物防治。

關鍵詞： 沃柑;潰瘍病;柑桔黃單胞柑桔亞種;病原鑒定;藥劑篩選;廣西南寧

中圖分類號： S436.661.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2703-10

Pathogen identification and bactericide screening of

Orah citrus canker

ZHAO Hong-tao1， CHEN Dong-kui1* ， CHEN Xiang-ling1， OU Zhi-tao1，

HUANG Qi-chun1， ZHANG Lan1， LI Guo-guo1， LIU Yao-xin1， YE Yun-feng1， FU Gang2

（1Horticulture Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China; 2Plant Protection Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】In order to provide the basis for the control of the Orah citrus canker，the Orah citrus canker pathogen was clarified and field medicines were screened in Nanning，Guangxi. 【Method】The bacteria were isolated and purified with tissue separation.And the pathogenicity was verified according to Koch’s rule. It was identified by morphological observation and 16S rDNA sequence analysis combining establishment of the phylogenetic tree.The pathogen were tested by plate confrontation method，and 14 kinds of bactericide were used to test its toxicities in laboratory，then carried out prevention and control in field. 【Result】The pathogen of Orah citrus canker was identified，which has a strain A of Xanthomonas citri subsp. citri in Nanning，Guangxi. The toxicity test results showed that 80% mancozeb WP， 20billion/g Bacillus subtilis WP，1.6% benziothiazolinone PF，1.8% xinjunan acetate SL and 3% Zhongshengmycin WP manifested evident antibacterial effects.With the dilution of 500， 1000， 2000， 4000 and 8000 times，the 80% mancozeb WP showed the optimal effect in the inhibitory rates of 77.4%， 75.2%， 64.7%， 63.0% and 58.3%， and lower effective concentration （EC50） of 49.09 mg/L; the inhibitory rates of 20 billion/g B.subtilis WP inhibitory rates were 73.5%，67.4%，64.5%，61.5% and 51.2%， and high EC50 was 81.47 mg/L. Field efficacy trials have shown 20 billion/g B. subtilis WP and 1.6% benziothiazolinone PF had good control effect on Orah canker，the control effects were 73.45% and 71.07% respectively. 【Conclusion】The pathogenof Orah citrus canker is identified as X.citri subsp. citri strain A isolated from Nanning， Guangxi. The 20 billion/g B.subtilis WP can be a good choice for a biological control of Orah citrus canker disease.

Key words： Orah; citrus canker; Xanthomonas citri subsp. citri; pathogen identification; bactericide screening; Nanning， Guangxi

0 引言

【研究意義】沃柑（Orah）為坦普爾桔橙與單西紅桔的雜交種，具有樹勢強健、果實外觀漂亮、品質優良、晚熟高糖、早結豐產等優點（江東和曹立，2011;黃其椿等，2014;趙洪濤等，2016），2012年引種到廣西南寧種植，因其優異的表現，2014年后呈暴發式擴張，截至2018年底廣西沃柑種植面積接近10萬ha，約占全國總面積的一半。沃柑是當前我國種植面積和影響力最大的晚熟柑橘品種，在廣西是繼沙糖桔后最主要的柑橘品種。但沃柑對潰瘍病敏感，潰瘍病已成為沃柑種植區最嚴重的病害，是制約沃柑產業進一步發展的重要因素。柑橘潰瘍病是世界范圍內危害柑橘產業的重要細菌性檢疫病害，主要在柑橘新梢抽發期和幼果期為害葉片、枝梢和果實，受害處出現病斑或木栓化，嚴重的會造成落葉、枯梢、落果，影響柑橘的產量和品質，該病害傳播速度快、防治難度大。潰瘍病菌系分化較復雜，不同菌系在基因和致病性方面存在差異。因此，研究沃柑潰瘍病病原菌種類并有針對性地進行防治藥劑篩選，對沃柑潰瘍病防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】柑橘潰瘍病菌系根據地理分布及對寄主植物的致病性差異分為A、B、C、D和E等5個菌系，A菌系又稱亞洲種，屬柑橘黃單胞柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp.citri），是致病力最強、最廣泛的菌系;B菌系為美洲種（X. fuscans pv. aurantifolii），主要危害南美洲的檸檬和墨西哥萊檬;C菌系從巴西圣保羅的墨西哥萊檬中分離獲得，可侵染酸橙;D菌系發現于墨西哥科利馬地區，主要侵染墨西哥萊檬;E菌系發現于美國佛羅里達，只侵染墨西哥萊檬（姚廷山等，2015）;后來有學者又進一步發現A菌系中存在AW和A*的變異菌系（Vauterin et al.，2000;da Silva et al.，2002）。雖然潰瘍病的發生至今已有100多年歷史，但目前仍無有效方法可完全根治，生產上主要依靠化學藥劑進行防治。美國多采用大面積焚毀根除法（Graham et al.，2004），但損失巨大;我國疫區以化學防治為主，根據藥劑分類，主要為銅制劑、鏈霉素類及其他藥劑。不同藥劑因柑橘品種和實驗地點不同，其防治效果也存在差異（袁承東，1993）。孫惠敏等（2011）研究了非銅藥劑和含銅藥劑對柑橘潰瘍病的毒力，結果表明代森錳鋅和福美雙等的抑菌作用最強;成秀娟等（2012）研究表明，400 mg/kg的松脂酸銅20%可濕性粉劑對潰瘍病的防治效果達70.69%～75.35%，是較理想的柑橘潰瘍病防治藥劑;李建揮等（2013）研究表明，表面活性劑能提高銅制劑對冰糖橙上潰瘍病的防治效果;宋曉兵等（2014）連續2年研究了復配藥劑25%春雷霉素·葉枯唑WP對柑橘潰瘍病的田間防治效果，結果顯示25%春雷霉素·葉枯唑WP 500 mg/kg處理2年的平均防效分別為80.80%和84.64%， 顯著高于對照藥劑處理。但長期施用化學藥劑防治會產生藥物殘留和環境污染等問題，并造成病菌抗藥性增強（Behlaiu et al.，2011），因此利用生防微生物進行以菌治菌的綠色防治尤為重要。生防微生物主要包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fuorescens）、草生歐氏桿菌（Erwinia herbicala）和丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等（Das，2003）。姚廷山等（2014）從土壤中篩選的拮抗放線菌A16對柑橘潰瘍病菌有較強的拮抗作用，抑菌圈直徑為26.00 mm;劉冰等（2015）通過枯草芽孢桿菌與農用鏈霉素混用后抑菌效果提高20.7%?！颈狙芯壳腥朦c】前人已對其他柑橘類潰瘍病防治進行了相關研究，但有關沃柑潰瘍病病原菌種類及防治藥劑的研究未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過病原菌形態學特征觀察、病原菌驗證并結合16S rDNA基因序列分析進行廣西南寧沃柑潰瘍病病原菌鑒定，同時測定14種常用藥劑對該病原菌的室內防效，篩選出能有效抑制該病原菌菌絲生長的藥劑，繼而進行田間藥效試驗，以期為柑橘潰瘍病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試樣品 2017年7月在廣西南寧市武鳴區城廂鎮廣西鳴鳴果園沃柑基地的東南西北中5點進行采樣，每點選擇1株感染潰瘍病的沃柑樹，戴無菌手套采集具有典型潰瘍病的葉片，每株采集10張葉片，5個點共采集50張樣品，未經處理分別裝入干凈的密封袋中常溫保存送至實驗室進行處理。接種用健康沃柑葉片采集于廣西農業科學院科研基地避雨防蟲網棚內沃柑樹。

1. 1. 2 供試藥劑 14種供試藥劑見表1。

1. 2 病原菌分離及鑒定

1. 2. 1 病原菌分離純化 參照方中達（2001）的方法進行病原菌分離。選取病健交界處葉片組織，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞消毒1 min，再用無菌水漂洗3次;選取10塊已消毒好的葉片組織置于滅菌研缽，加入1 mL無菌水，用滅菌研磨棒進行研磨;用接種環蘸取研磨液在牛肉膏蛋白胨瓊脂（NA）培養基上進行劃線，于28 ℃下培養48 h，挑取單菌落進行純化培養。

NA培養基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、瓊脂18.0 g，加水定容至1000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1. 2. 2 病原菌驗證 參照李云鋒和李祥（2000）的方法進行病原菌驗證。將分離純化的細菌菌株接種到NA培養基上，于28 ℃下培養48 h，將培養的細菌用無菌水配制成濃度約108 CFU/mL的菌懸液。在廣西農業科學院科研基地從3株健康的沃柑采集夏梢葉片，每株采集9片共27片沃柑葉片，放置于密封袋常溫保存帶回實驗室用自來水沖洗干凈，晾干用于病原菌接種。用滅菌大頭針在健康柑桔葉片上刺出傷口，再用移液器吸取20 μL菌液接種到傷口上，每個菌株測試3張葉片，3次重復共9張葉片，每張葉片接種4個傷口，以接種等量無菌水作對照。接種葉片置于28 ℃下保濕培養，定期觀察葉片發病情況，對發病葉片進行病原菌再分離，并通過柯赫氏法則驗證病原菌。

1. 2. 3 病原菌形態學鑒定 對病原菌在NA培養基上的菌落形態進行觀察和描述，進行病原菌形態學鑒定。

1. 2. 4 16S rDNA分子生物學鑒定 參考樓兵干等（2009）的方法進行病原菌分子生物學鑒定。采用試劑盒提取病原菌基因組DNA，使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-G GTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA序列擴增。PCR反應體系25.0 μL：10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物27F（10 μmol/L） 1.0 μL，引物1492R（10 μmol/L）1.0 μL，DNA模板100 ng，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，委托上海鼎安生物科技有取公司采用ABI 3730型基因分析儀進行測序，測序結果用BLAST在GenBank數據庫中進行同源性比對，運用ClustalW對序列進行多重比較，使用MEGA 6.0以NJ法進行聚類分析，構建系統發育進化樹。

1. 3 14種藥劑對潰瘍病病原菌的室內毒力測定

1. 3. 1 含菌培養基制備 將鑒定的柑橘潰瘍病病原菌菌株接種于含NA培養基的平皿中，于28 ℃下培養48 h，在培養皿中加入25 mL無菌水，用無菌接種環刮下菌苔，制成濃度為1010 CUF/mL的菌懸液，用移液器吸取1 mL菌懸液加入99 mL冷卻至45 ℃的NA培養基中充分搖勻，制成含菌濃度為108 CUF/mL的含菌培養基，然后倒皿，每皿倒20 mL培養基。

1. 3. 2 藥劑配制及稀釋 供試的14種藥劑由高濃度向低濃度成倍稀釋。先用無菌水配制500倍溶液，依次向低濃度稀釋獲得1000、2000、4000和8000倍藥液，藥劑的含量分別為2000、1000、500、250和125 mg/L，以清水為對照（CK）。

1. 3. 3 抑菌作用測定 用直徑為6 mm的滅菌打孔器在含菌培養基上打出等邊三角形的3個孔，吹干孔內水分。各取不同濃度的藥劑50 μL加入到孔中，每個濃度重復3次，無菌水作對照，28 ℃恒溫培養48 h后用十字交叉法測量抑菌圈直徑，計算不同濃度藥劑下的抑菌圈平均值。

1. 3. 4 數據處理 根據抑菌圈直徑計算相對抑菌率，相對抑菌率（%）=（處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑）/處理抑菌圈直徑×100。以藥劑濃度對數值為自變量（x）、相對抑菌率的幾率值為因變量（y），建立毒力回歸方程，計算相關系數（R）和抑菌有效中濃度（EC50）。

1. 4 防治藥劑田間效果測定

1. 4. 1 試驗材料 選取室內防治藥劑篩選中表現出一定抑菌效果的5種藥劑（80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑）進行田間柑橘潰瘍病防治試驗。

試驗在南寧市武鳴區城廂鎮九聯村廣西鳴鳴果業有限公司基地進行，品種為沃柑，樹齡四年，長勢強壯，株行距2 m×4 m，密度為1245株/ha，肥水管理較好，潰瘍病發生程度中等。

1. 4. 2 試驗設計 試驗設80%代森錳鋅可濕性粉劑500倍液、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑500倍液、1.6%噻霉酮涂抹劑400倍液、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑600倍液、3%中生菌素可濕性粉劑900倍液和清水對照，共6個處理，每處理4次重復，共24個小區。每個供試藥劑為一處理小區，小區隨機區組排列，每小區10株沃柑樹，小區間設1行分隔樹，各小區的樹齡、樹勢和管理水平等均基本一致。對不同藥劑采用人工噴霧法進行潰瘍病防治，將藥液均勻噴布于葉片正面和背面及果實上。

1. 4. 3 調查項目及方法 于夏梢新葉展開時（2018年5月20日）開始第1次噴藥，每隔10～15 d噴1次，共噴3次（5月30日噴第2次，6月15日噴第3次），末次噴藥后15 d（6月30日）調查夏梢葉片潰瘍病發病情況。由于藥前夏梢葉片尚未發病，故未作病情基數調查。每試驗小區選擇有代表性的2株沃柑樹進行調查，每株樹按東南西北中5個方位取樣，每個方位調查2個秋梢的全部葉片，2株樹共調查20個梢。

病情分級標準：0級，無病斑;1級，每葉有1～5個病斑;3級，每葉有6～10個病斑;5級，每葉有11～15個病斑;7級，每葉有16～20個病斑;9級，每葉有21個以上病斑。

病情指數（%）=[∑（各級病葉數×相對級數值）/調查總葉數×9]×100

防治效果（%）=（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情況指數×100

1. 4. 4 統計分析 采用SPSS 17.0的ANOVA法對試驗數據進行方差分析，采用Duncan’s新復極差法比較各處理的防治效果，分析其差異顯著性。

2 結果與分析

2. 1 病害癥狀

潰瘍病菌一般只侵染幼嫩的組織，如嫩葉、嫩梢和幼葉，葉片被侵染后在其背面出現針頭大小的油漬狀斑點，然后擴大穿透葉片，在葉片正面出來近圓形病斑，表面粗糙，后期組織木栓化形成火山口開裂，病健交界處出現黃綠暈圈，危害枝條和果實時木栓化更嚴重，形成木栓化病斑，但潰瘍病對果肉沒有影響（圖1）。

2. 2 病原菌分離及鑒定

2. 2. 1 病原菌分離和驗證 從沃柑病葉組織上分離獲得2株細菌，分別命名為G1和G2，將2株細菌通過針刺接種法接種到健康的柑桔葉片上，接種G1菌株的葉片在接種后第8 d出現明顯的褐色水漬狀病斑（圖2-a），第10 d針刺點葉背出現隆起，病斑處出現白色海綿狀物質堆積，呈典型的火山口突起（圖2-b）;而接種G2菌株的葉片未出現病癥，對照葉片也未出現病癥（圖2-c）。通過柯赫氏證病試驗，從離體葉片發病部位分離出的病原菌與接種的G1菌株相同。

2. 2. 2 病原菌形態學鑒定結果 病原菌G1在NA培養基上形成的菌落呈黃色、黏液狀、圓形、表面光滑、稍隆起（圖3-a），菌落背面也為黃色（圖3-b），與已報道的柑橘潰瘍病菌相似（吳明瓊，2018）。

2. 2. 3 生物信息學分析結果 對沃柑潰瘍病病原菌G1菌株16S rDNA序列的PCR擴增產物進行測序，結果獲得1417 bp的片段序列（登錄號MK121207），BLAST比對結果（圖4）顯示，其序列與柑桔黃單胞柑桔亞種（X. citri subsp. citri）的同源性為100%，因此將G1菌株鑒定為柑桔黃單胞柑桔亞種。從構建的系統發育進化樹（圖5）也可看出，G1菌株與多個已報道的柑桔黃單胞柑桔亞種聚在一個分支內。

綜合病原菌的形態特征、致病性、16S rDNA序列分析和系統發育進化樹結果，進一步將沃柑潰瘍病病原菌鑒定為柑桔黃單胞柑桔亞種，為潰瘍病A菌系（姚廷山等，2015）。

2. 3 14種藥劑對潰瘍病病原菌的室內毒力測定結果及毒力回歸方程

室內抑菌試驗結果（表2）顯示，供試的14種藥劑中只有80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑等5種藥劑對沃柑潰瘍病病原菌表現出一定的抑制效果。在500、1000、2000、4000和8000倍稀釋濃度下，80%代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果最好，抑菌率分別為77.4%、75.2%、64.7%、63.0%和58.3%，其次是200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，抑菌率分別為73.5%、67.4%、64.5%、61.5%和51.2%，而1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑在藥劑稀釋倍數較低的情況下有一定的抑菌作用但效果較差，在藥劑稀釋倍數較高的情況下無抑菌效果。其余9種藥劑沒有抑菌效果。

根據抑菌圈直徑，建立供試藥劑的毒力回歸方程，計算、比較80%代森錳鋅可濕性粉劑和200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的EC50。結果顯示，80%代森錳鋅可濕性粉劑的毒力回歸方程為y=0.463x+4.217，R=0.933，EC50較低，為49.09 mg/L，抑菌效果較好;而200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的毒力回歸方程為y=0.449x+4.142，R=0.948，EC50較高，為81.47 mg/L，抑菌效果稍差。

2. 4 田間藥劑篩選結果

選取室內藥劑篩選中表現出一定抑制效果的5種藥劑（80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑）進行田間防治試驗，結果（表3）顯示，5種防治藥劑對沃柑潰瘍病的防治效果在61.81%～73.45%，防治效果排序為200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（73.45%）>1.6%噻霉酮涂抹劑（71.07%）>1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（66.53%）>80%代森錳鋅可濕性粉劑（65.14%）>3%中生菌素可濕性粉劑（61.81%）;其中，除3%中生菌素可濕性粉劑外，其余各處理對沃柑潰瘍病的防治效果差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

柑橘潰瘍病菌系具有品種特異性，但所產生的癥狀無明顯差異，需借助血清學、噬菌體敏感性、分子標記及寄主范圍等多種生物學特征進行病原菌分類鑒定。目前根據基因測序的差異可將柑橘潰瘍病分為柑橘黃單胞亞種（X. citri subsp. citri）、棕色黃單胞萊檬亞種（X. fuscans subsp. aurantifolii）和苜蓿黃單胞枳柚亞種（X. alfalfae subsp. citrumelonis）等3個亞種（Schaad et al.，2006）。本研究結合形態學觀察、致病性驗癥和分子鑒定，明確從廣西沃柑潰瘍病病葉上分離到的病原菌為柑橘黃單胞柑橘亞種，系柑橘潰瘍A菌系，與Schaad等（2006）的研究結果一致，是我國柑橘潰瘍病病原菌主要類型。

室內毒力是衡量藥劑對有害生物毒力作用大小的指標之一，是藥劑對有害生物所具有的內在致死能力，而田間藥效試驗更接近生產實際。本研究的室內毒力鑒定結果表明，14種供試藥劑中80%代森錳鋅可濕性粉劑、200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、1.6%噻霉酮涂抹劑、1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑和3%中生菌素可濕性粉劑對柑橘潰瘍病病原菌表現出一定的抑制效果，其余藥劑對病菌無抑制作用;田間藥效試驗結果表明，所選藥劑對沃柑潰瘍病的防治效果在61.81%～73.45%，其中200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的防效最好，1.6%噻霉酮涂抹劑次之。本研究中，常用的銅制劑如氫氧化銅沒有表現出抑菌效果，其原因可能是果園連續大量使用銅制劑防治潰瘍病，導致抗銅制劑的菌株產生。陳雪鳳等（2012）測定廣東、江西和廣西等地不同產區的21個柑橘潰瘍病菌對化學藥劑的敏感性，結果表明部分潰瘍病菌對藥劑產生了不同程度的抗藥性，其中有18個菌株對硫酸銅（必備）產生了不同程度的抗性，特別是來自廣東的菌株對硫酸銅已產生較強的抗性，來自江西的菌株對潰瘍克星產生中等以上抗性，來自廣西桂林的菌株對鏈霉素產生抗性，而枯草芽孢桿菌在廣西沃柑產區使用還較少，潰瘍病菌可能對其還未產生抗性。另外，田間防治效果與室內毒力測定結果不一致，可能與在實驗室毒力測定時的病菌濃度和田間藥劑試驗時樹體所帶的病菌濃度不一致有關;也可能是實驗室藥劑是直接與病菌接觸起到殺菌或抑菌作用，而在田間噴施，藥劑不一定直接接觸到病菌，有些潰瘍病菌在植株組織內部，如果不是內吸性藥劑就不能直接接觸到病菌;也可能是不同地區病原菌存在生理分化，或柑桔品種與栽培管理水平不同，病原菌在寄主上生長的適合度也不同，因而存在品種間感病性差異所致;以及與有些藥劑需在植物內活化后才能激活防治作用有關（姚廷山等，2011），具體原因還需進一步探究。在防治藥劑的篩選上，生防微生物制劑是未來綠色農業的選擇方向，譚小艷等（2006）從枯草芽孢桿菌分離出的Bv10變種對柑橘潰瘍病菌有較好的抑制作用;陳嬌梅等（2014）鑒定短小芽孢桿菌和芽孢桿菌對柑橘潰瘍病的防效達90.0%～100.0%。結合室內毒力測定和田間藥效試驗，本研究篩選的200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑屬于生防微生物藥劑，作為柑橘潰瘍病防治藥劑可降低化學藥劑的使用量，減少環境污染。

不同柑橘種類或品種對潰瘍病的抗性水平變化較明顯（張戈壁等，2004），其中甜橙和臍橙品種普遍容易感病，屬高度感病品種，而寬皮柑橘抗病性最強（宋盛英等，2002），但寬皮橘類的雜柑類為高感品種（胡秀榮等，2014）。廣西以前主要以沙糖桔和南豐蜜桔等寬皮柑橘為主，潰瘍病發生輕，為次要病害，近年來隨著沃柑的大面積發展，潰瘍病快速成為我區沃柑產區最重要的病害。潰瘍病在廣西沃柑上發生流行如此快速，主要有以下幾個原因：一是沃柑雖然是寬皮橘類，但其為含橙類基因的雜柑;二是沃柑生長速度快，葉片氣孔大，胞間不緊密，潰瘍病菌易侵入;三是廣西特別是桂南地區夏秋季節高溫多濕，沃柑有刺，在風雨天氣容易刺傷，加重了潰瘍病的感染和傳播;四是防治藥劑的持效性短，大多數銅制劑只有7～10 d的有效期，且常期使用銅制劑等造成抗性細菌產生。因此，建議采取農業和藥劑綜合防治沃柑潰瘍病，如選用無病苗木、合理施肥、清除田間病殘體、興建防風林、剪除刺、輪換用藥、每次新梢抽發時及時噴布高效低毒藥劑等。

4 結論

從廣西南寧分離出的沃柑潰瘍病病原菌為強致病性柑桔黃單胞柑桔亞種A菌系，生產上推薦使用200億活芽孢/g枯草芽孢桿菌進行生物防治。

參考文獻：

陳嬌梅，蔡學清，邱思鑫，胡方平. 2014. 柑橘潰瘍病生防細菌的分離鑒定[J]. 熱帶作物學報，35（7）：1398-1403. [Chen J M，Cai X Q，Qiu S X，Hu F P. 2014. Isolation and identification of biocontrol bacteria from citrus to Xanthomo-nas axonopodis pv.citri[J].Chinese Journal of Tropical Crops，35（7）：1398-1403.]

陳雪鳳，雷艷宜，葉凎，丁鈿，曾冬根，劉瓊光. 2012. 柑橘潰瘍病菌的藥劑篩選及抗藥性分析[J]. 華南農業大學學報，33（4）：460-464. [Chen X F，Lei Y Y，Ye G，Ding T，Zeng D G，Liu Q G. 2012. Screening of fungicides and drug resistance analysis for Xanthomonas axonopodis pv.citri[J]. Journal of South China Agricultural University，33（4）：460-464.]

成秀娟，徐偉松，周振標，張曉華，黃怡林. 2012. 松脂酸銅防治柑橘潰瘍病效果研究[J]. 農藥科學管理，33（7）：41-43. [Cheng X J，Xu W S，Zhou Z B，Zhang X H，Huang Y L.2012.Control efficacy of resin acid copper 20% WP against Xanthomonas campestris pv.citri[J]. Pesticide Science and Adminstration，33（7）：41-43.]

方中達. 2001. 植病研究方法[M]. 第3版. 北京：中國農業出版社. [Fang Z D. 2001. Plant disease research method[M]. The 3rd Edition. Beijing：China Agricultural Press.]

胡秀榮，黃振東，蒲占湑，杜丹超，林荷芳，鹿連明，陳國慶. 2014. 柑橘不同品種對潰瘍病抗病性差異的調查[J]. 浙江柑橘，31（1）：28-30. [Hu X R，Huang Z D，Pu Z X，Du D C，Lin H F，Lu L M，Chen G Q. 2014. Investigation on the difference of resistance of different citrus varieties to canker[J]. Zhejiang Ganju，31（1）：28-30.]

黃其椿，劉吉敏，何新華，黃克，冉志林，吳榮倫，羅捷，李初英. 2014. 晚熟雜柑“沃柑”在廣西武鳴的栽培表現初報[J]. 中國南方果樹，43（3）：86-88. [Huang Q C，Liu J M，He X H，Huang K，Ran Z L，Wu R L，Luo J，Li C Y. 2014. Preliminary study of performance of late maturing hybrid citrus “Orah” during the cultivation in Wuming of Guangxi[J]. South China Fruits，43（3）： 86-88.]

江東，曹立. 2011. 晚熟高糖雜柑品種“沃柑”在重慶的引種表現[J]. 中國南方果樹，40（5）：33-34. [Jiang D， Cao L. 2011. Performance of late maturing hybrid citrus “Orah” after introduction to Chongqing[J]. South China Fruits，40（5）：33-34 .]

李建揮，張浩琪，李娜，舒廣平，谷元洪，鄧子牛. 2013. 5種表面活性劑對銅制劑防治冰糖橙潰瘍病效果的影響[J]. 湖南農業科學，（5）：71-73. [Li J H， Zhang H Q，Li N， Shu G P，Gu Y H，Deng Z N. 2013. Influences of five surface active agents on control effect of copper fungicides to citrus canker disease of Bingtang sweet orange[J]. Hunan Agricultural Sciences，（5）：71-73.]

李云鋒，李祥. 2000. 柑桔潰瘍病病菌離體葉接種檢驗法的研究[J]. 華中農業大學學報，19（5）：421-423. [Li Y F，Li X. 2000. Detection method of inoculation on citrus leaves in vitro with Xanthomonas axonopodis pv.citri[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，19（5）：421-423.]

劉冰，宋水林，劉曉麗，楊明霞，龔玲玲. 2015. 柑橘潰瘍病生防內生細菌的篩選、鑒定及其活性代謝產物的穩定性[J]. 浙江農業學報，27（12）：2152-2158. [Liu B，Song S L，Liu X L，Yang M X，Gong L L. 2015. Screening，identification of bio-control endophytic bacterium against ci-trus canker and stability of its bioactive metabolites[J]. Acta Agriculturae Zhejiangeniss，27（12）：2152-2158.]

樓兵干，陳吳健，林釵，王國榮，夏國綿，樓曼慶. 2009. 一種新大豆豆莢炭疽病癥狀類型及其病原鑒定[J]. 植物保護學報，36（3）：229-233. [Lou B G，Chen W J，Lin C，Wang G R，Xia G M，Lou M Q. 2009. A new symptom type of soybean pod anthracnose and identification of its pathogen[J]. Journal of Plant Protection，36（3）：229-233.]

宋盛英，楊光蘭，潘盛勇，趙春穆，石安鳩. 2002. 不同柑橘品種對柑橘潰瘍病的抗性調查[J]. 中國森林病蟲，21（2）：34-36. [Song S Y，Yang G L，Pan S Y，Zhao C M，Shi A J. 2002. Investigation on the resistance of different varieties of citrus to Xanthomonas citri[J]. Forest Pest and Disease，21（2）：34-36.]

宋曉兵，彭埃天，陳霞，凌金鋒，程保平. 2014. 25%春雷霉素·葉枯唑WP對柑橘潰瘍病的應用效果評價[J]. 農藥， 53（8）：603-604. [Song X B，Peng A T，Chen X，Ling J F，Cheng B P. 2014. Application evaluation of kasugamycin.bismerthiazol 25% WP on Citrus bacterian canker disease[J]. Agrochemicals，53（8）：603-604.]

孫惠敏，李保同，郭明程，陳慈相，謝金招，劉德力. 2011. 幾種殺菌劑對柑橘潰瘍病的生物活性[J]. 江西農業大學學報，33（1）：38-42. [Sun H M，Li B T，Guo M C，Chen C X，Xie J Z，Liu D L. 2011. Bioactivity of several bactericides against Xanthomonas campestris pv.citri[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，33（1）：38-42.]

譚小艷，黃思良，晏衛紅，任建國，岑貞陸. 2006. 柑橘潰瘍病菌的拮抗細菌Bv10的研究[J]. 廣西農業生物學報，25（3）：229-234. [Tan X Y，Huang S L，Yan W H，Ren J G，Cen Z L. 2006. Study on antagonistic strain Bv10 of Bacillus subtilis against citrus canker[J]. Journal of Guangxi Agricultural and Biological Science，25（3）：229-234.]

吳明瓊. 2018. 柑橘潰瘍病菌拮抗細菌篩選和藥劑防治試驗[D]. 南寧. 廣西大學. [Wu M Q. 2018. Antagonistic bacteria screening of Xanthomonas citri subsp. citri and chemical control experiment of citrus canker disease[D]. Nanning：Guangxi University.]

姚廷山，周常勇，胡軍華，雷慧德，冉春，李鴻筠，劉浩強，肖田. 2011. 柑桔潰瘍病防治藥劑的篩選研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學版），26（1）：30-33. [Yao T S，Zhou C Y，Hu J H，Lei H D，Ran C，Li H J，Liu H Q，Xiao T. 2011. Sceening of Control Bactericides of Xanthomonas axonopodis pv.citri[J]. Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science），26（1）：30-33.]

姚廷山，周常勇，胡軍華，冉春，李鴻筠，劉浩強. 2014. 柑橘潰瘍病土壤拮抗放線菌的分離及菌株A16初步鑒定[J]. 果樹學報， 31（4）：684-688. [Yao T S，Zhou C Y，Hu J H，Ran C，Li H J，Liu H Q. 2014. Screening of antagonistic actinanyces strains against citrus canker disease and A16 identification[J]. Journal of Fruit Science，31（4）：684-688.]

姚廷山，周彥，周常勇. 2015. 柑橘潰瘍病菌分化及防治研究進展[J]. 園藝學報，42（9）：1699-1706. [Yao T S，Zhou Y，Zhou C Y. 2015. Research development of the diffe-rentiation and control of citrus bacterial canker disease[J]. Acta Horticulturae Sinica，42（9）：1699-1706.]

袁承東. 1993. 柑桔潰瘍病在國內外的危害防治及研究綜述[J]. 植物檢疫，7（5）：369-373. [Yuan C D.1993. Review on the harm control and research of Citrus bacteria canker disease at home and abroad[J]. Plant Quarantine，7（5）：369-373.]

張戈壁，陽廷密，李喜慶，陳竹生. 2004. 不同柑桔品種對柑桔潰瘍病抗病能力的測定[J]. 植物保護學報， 31（2）：221-222. [Zhang G B，Yang T M，Li X Q， Chen Z S. 2004. The resistance of citrus varieties to citrus canker caused by Xanthomonas citri[J]. Journal of Plant Protection， 31（2）：221-222.]

趙洪濤，李果果，劉要鑫，張蘭，歐智濤，趙小龍，陳東奎，黃其椿，廖惠紅，王茜，黃宏明，莫凱琳，陳香玲. 2016. 沃柑在廣西發展的優劣分析及對策探討[J]. 南方園藝，27（3）：12-16. [Zhao H T，Li G G，Liu Y X，Zhang L，Ou Z T，Zhao X L，Chen D K，Huang Q C，Liao H H，Wang X，Huang H M，Mo K L，Chen X L.2016. Analysis and countermeasures of the development of “Orah” in Guangxi[J]. Southern Horticulture，27（3）：12-16.]

Behlaiu F，Canteros B L，Minsavage G V，Jones J B，Graham J H. 2011. Molecular characterization of copper resistance genes from Xanthomonas citri subsp. citri and Xanthomonas alfalfa subsp. citrumelonis[J]. Applied and Ervironmental Microbiology，77（12）：4089-4096.

da Sliva A C，Ferro J A，Reinach F C，Farah C S，Furian L R，Quaggio R B，Monteiro-Vitorello C B，van Sluys M A，Almeida? N F，Alves L M C，do Amaral A M，Bertolini M C，Camargo L E A，Camarotte G，Cannavan F，Cardozo J，Chambergo F，Ciapina L P. 2002. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with diffe-ring host specificities[J]. Nature，417（6887）：459-463.

Das A K. 2003. Citrus canker-a revies[J]. Journal of Applied Horticulture，5（1）：52-60.

Graham J H，Gottwald T R，Gubero J，Achor D S. 2004. Xanthomonas axonopdis pv.citri：Factors affecting successful eradication of citrus canker[J]. Molecular Plant Pathology，5（1）：1-15.

Schaad N W，Elena P，George L，Aaron S，Irina A，Stromberg P E，Stromberg V K，Vidaver A K. 2006. Emended classification of Xanthomonad pathogens on citrus[J]. Systema-tic and Applied Microbiology，29（8）：690-695.

Vauterin L，Rademarker J，Swings J. 2000. Synopsis on the taxonomy of the genus Xanthmonas[J]. Phytopathology， 90（7）： 677-682.

（責任編輯 麻小燕）