苜蓿胚性愈傷組織誘導及植株再生研究

王紅梅

摘要：以苜蓿5～7 d苗齡無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，研究培養基中不同激素和濃度配比對苜蓿愈傷組織誘導和分化的影響。結果表明，MS+2，4-D 2.0 mg/L +6-BA 1.0 mg/L愈傷組織誘導率達100%，且愈傷組織狀態良好，增殖速度快。MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L為苜蓿胚性愈傷組織誘導的適宜培養基，誘導率為37.8%。胚性愈傷組織分化成苗培養基為MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L，生根培養基為1/2MS+ NAA 0.02 mg/L +蔗糖10.0 g/L。

關鍵詞：苜蓿;胚性愈傷組織;誘導;植株再生

中圖分類號：S551.7 ? ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2019）10-0024-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.07.006

Key words：Medicago sativa Linn;Embryogenic callus;Induction;Plant regeneration

苜蓿（Medicago sativa Linn）為豆科苜蓿屬多年生宿根草本植物。苜蓿營養價值高，蛋白質占其干重的15%～22%，適口性好，易于消化吸收，是世界上公認的綠色優質牧草，被譽為“牧草之王”[1 ]。同時苜蓿具有抗寒抗旱、耐瘠薄、防風固沙及改善土壤養分等特點[2 - 4 ]，大面積種植優質苜蓿，對促進我國畜牧業發展和西部生態系統恢復與重建具有重要意義。但苜蓿屬于典型的異花受粉植物，自交結實率極低，通常為1%～3%，通過常規雜交育種方法進行品質改良難以實現[5 - 6 ]。借助于植物組織培養和現代生物技術，不僅可以克服苜蓿種子產量低的困難，而且能夠將優質、高產、抗病蟲害、耐鹽堿等相關基因導入苜蓿，培育適合在不同生態環境下種植的品種[7 - 8 ]，加快育種進程，豐富苜蓿種質資源。

目前，通過轉基因改良植物遺傳特性的技術已滲透到農業生產的方方面面。我國關于苜蓿轉基因研究的報道較多，有通過轉基因技術改良抗寒[9 ]、耐鹽堿[10 ]，以至作為生物反應器表達免疫蛋白等的研究[11 ]，但普遍存在體細胞胚誘導困難、植株分化率低、試驗周期長、轉化效率低等問題[12 ]，嚴重制約轉基因技術在苜蓿遺傳改良中的應用。誘導苜蓿愈傷組織的形成和組織、器官的形態建成是實現苜蓿細胞培養和遺傳轉化的關鍵環節。我們以苜蓿子葉和下胚軸為外植體，通過探索和優化培養基成分和植物外源激素的種類和配比來誘導胚性愈傷組織形成，由胚性愈傷組織進而分化形成新的植株，建立苜蓿高頻再生體系，以期為進一步開展苜蓿細胞培養和遺傳轉化研究提供支持。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料

指示苜蓿品種為甘農1號，由甘肅農業大學草業學院曹致中教授提供，為適宜在我國西北部、甘南草原、青藏高原邊緣種植的抗寒、抗旱優良品種。

1.2 ? 方法

1.2.1 ? ?種子消毒處理 ? ?選取飽滿的苜蓿種子，在流水下沖洗30 min，75%酒精消毒45 s，0.1%升汞振蕩消毒8 min，無菌水漂洗4次（每次2 min），用無菌濾紙吸干，接種到MS培養基上，于（23±2） ℃條件下暗培養。待種子萌發后轉至16 h光照/8 h黑暗條件下培養。

1.2.2 ? ?外植體的建立 ? ?取5～7 d苗齡的無菌實生苗子葉和下胚軸，將子葉沿葉脈方向切成兩半，下胚軸切成0.5 cm左右的切斷，分別接種在愈傷組織誘導培養基上。每處理接種子葉和下胚軸各20個，3次重復。外植體暗培養3 d后，轉16 h光照、8 h黑暗，光強度為2 500 lx，溫度（23±2） ℃條件下培養。

1.2.3 ? ?培養基 ? ?誘導培養基3種，Ⅰ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L;Ⅱ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT1.0 mg/L;Ⅲ型為MS+2，4-D 2.0 mg/L +6-BA 1.0 mg/L。胚性愈傷組織誘導培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.05～ 0.20 mg/L。分化培養基為MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 0.01～0.05 mg/L。生根培養基為1/2MS+ NAA 0～0.03 mg/L +蔗糖7.5～15.0 g/L。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 不同激素及其配比對苜蓿愈傷組織誘導的影響

以MS為基本培養基，不同的植物外源激素和濃度配比對苜蓿外植體愈傷組織誘導率和愈傷組織狀態有較大影響（表1）。

從觀察結果看出，3種培養基均可誘導外植體形成愈傷組織，但誘導率差異明顯，狀態各不相同。從外植體細胞開始分裂的時間來看，Ⅲ型培養基啟動細胞分裂的時間最短，僅為2～3 d;其次是Ⅰ型培養基;Ⅱ型培養基細胞啟動時間最長，為8～10 d。3種培養基愈傷組織誘導率差異明顯，由高到低依次為Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。從愈傷組織生長狀態來看，Ⅰ型培養基、Ⅱ型培養基誘導子葉產生的質地緊密，生長緩慢，由下胚軸形成的愈傷組織呈白色粉末或無色水漬狀，生長快但易于褐化;外植體在Ⅲ型培養基上培養10 d時，子葉形成的愈傷組織呈新鮮的黃綠色，表面有顆粒狀突起，下胚軸愈傷組織呈淺黃綠色塊狀，質地疏松，增殖快（圖1，圖2）。綜合來看，2，4-D與6-BA配合使用，比單一使用2，4-D效果更好。在Ⅱ型培養基中，因加入了激動素KT，反而抑制了愈傷組織的誘導，說明了KT不利于啟動苜蓿細胞的分裂?？梢?，甘農1號子葉和下胚軸愈傷組織誘導以2，4-D與6-BA配合使用效果較好， MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L是愈傷組織誘導的適宜培養基。

2.2 ? 激素對苜蓿胚性愈傷組織形成的影響

由子葉和下胚軸形成的愈傷組織繼代培養2～3次后，轉接到添加6-BA和NAA的培養基上培養21 d時，部分愈傷組織逐漸轉變為顆粒狀的胚性愈傷組織，不同激素配比下胚性愈傷組織形成效果差異明顯（表2）。

觀察發現，6-BA與低濃度NAA配合使用可促使苜蓿愈傷組織轉變成為胚性愈傷組織，且子葉胚性愈傷組織誘導率高于下胚軸。在6-BA濃度為0.5 mg/L的條件下，低濃度的NAA更有利于體細胞胚的形成，此時的愈傷組織表面有顆粒狀突起，結構疏松分散性好，呈淡黃綠色有光澤（圖3 ）。當NAA濃度由0.05 mg/L增加到0.20 mg/L時，子葉胚性愈傷組織誘導率由37.8%降低到8.9%，可見在6-BA存在的前提下，NAA的濃度對胚性愈傷組織形成起決定性作用。在相同培養條件下，下胚軸愈傷組織增殖速度較快，呈淺綠色塊狀（圖4），但胚性愈傷組織誘導率最高僅為6.7%。

2.3 ? 苜蓿胚性愈傷組織分化成苗

苜蓿胚性愈傷組織形成后，在MS培養基中添加0.2 mg/L的6-BA的條件下，配合使用0.01～0.05 mg/L的NAA，在16 h光照/8 h黑暗條件下培養10～20 d則有助于植株形態的建成（圖5），其中胚性愈傷組織接種在培養基MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.01 mg/L上時分化成苗率可達75.2%。

2.4 ? 再生植株生根培養

將再生植株轉接到蔗糖用量分別為7.5、10.0、15.0 g/L的1/2MS培養基上，培養20 d后陸續有乳白色根生成，且隨著蔗糖用量的提高生根所需時間延長。在3種培養基中，以蔗糖用量為10.0 g/L的1/2MS生根時間較短，根的狀態較好，有2～3個分叉。當蔗糖用量提高到15.0 g/L時，生根時間延長7 d左右，且生成的根細長，側根少，可見高濃度蔗糖對苜蓿生根有抑制作用。將培養基調整為1/2MS+ NAA 0.02 mg/L +蔗糖10.0 g/L時，再生植株生根時間縮短，10～15 d內生根，根數量多，狀態好（圖6），有利于提高移栽成活率。

3 ? 結論與討論

植物組織培養中可利用的外植體類型很多，如葉片、葉柄、花瓣、花藥、種子、塊莖、鱗片、根尖等。以種子為培養材料的，大多數是將種子消毒后接種子培養基上，萌發后取無菌實生苗的子葉、下胚軸或根尖為外植體。本研究取苜蓿子葉和下胚軸為材料，從結果可以看出，愈傷組織誘導和分化在二者之間都有差異。單從愈傷組織誘導率來講，下胚軸誘導率大于子葉;但從愈傷組織狀態來看，子葉愈傷組織呈新鮮的黃綠色，表面有顆粒狀突起，分化成苗的幾率比較大，而下胚軸愈傷組織呈白色雪花狀或淺綠色塊狀，分散性好，生長旺盛，分化成苗難度大，可作為苜蓿細胞懸浮培養的首選材料。

激素種類及配比對植物愈傷組織的誘導和芽、根等器官的形成起著重要的調節作 用[13 ]。在本研究中，單獨使用2，4-D，或2，4-D與6-BA、KT配合使用，均能不同程度地誘導苜蓿外植體產生愈傷組織，但以2，4-D與6-BA質量配比為2∶1時誘導率達100%，愈傷組織狀態較好，這與伊風艷 ? ?等[14 ] 、秦楚等[12 ]關于苜蓿愈傷組織誘導及分化培養研究的結果一致。李聰等[15 ]認為KT在苜蓿誘導分化過程中起著關鍵調控作用，但本研究發現，添加了KT培養基的甘農1號愈傷組織誘導率下降。因此，使用一種或幾種培養基并不適合所有苜蓿品種愈傷誘導和再分化，針對不同基因型選擇愈傷組織誘導和再生的激素種類和濃度是必要的。

對植物器官、組織、細胞離體培養所產生的愈傷組織，在一定條件下可進一步誘導器官再生或胚狀體而形成植株。本研究結果表明，影響苜蓿愈傷組織繼代培養的主要因素是激素，如果保持較高的生長素（2，4-D 2.0 mg/L）和細胞分裂素（6-BA 1.0 mg/L）濃度，則愈傷組織生長旺盛，增殖速度快，但隨著繼代次數的增多，其分化成苗的能力下降。在去除2，4-D、降低6-BA濃度（0.5 mg/L）的條件下，在培養基中添加NAA 0.05～0.10 mg/L有利于苜蓿胚性愈傷組織誘導，誘導率最高為37.8%。胚性愈傷組織的誘導是解決苜蓿外植體再生頻率低的有效途徑。同時，胚性愈傷組織呈淺黃色松散顆粒狀結構，活性好，增殖速度快，可作為苜蓿遺傳轉化研究的理想受體材料，降低嵌合體的形成，大幅度提高遺傳轉化效率。

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（本文責編：楊 ? ?杰）