單分子技術在G蛋白偶聯受體二聚體中的應用

蔡 欣，王春勇，王德秀，蘇文霞，魯 洪，王鳳斌

(1. 濰坊醫學院臨床醫學院生理學教研室，山東 濰坊 261053; 2. 壽光市人民醫院腎內科，山東 壽光 262700)

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)構成最大的細胞膜受體超家族，是重要的藥物靶點，其相關藥物占市場上藥物的40～50%。大量研究表明，GPCRs不僅能以單體的形式發揮生物學作用，也可以相互作用形成同源/異源二聚體，甚至高階寡聚體，并具有獨特的功能，如Apelin受體(putative receptor protein related to AT1，APJ)和血管緊張素1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)形成的異源二聚體，配體Apelin能通過該二聚體，抑制血管緊張素介導的動脈粥樣硬化[1]。目前，GPCR二聚化的研究方法有很多，如免疫共沉淀、共振能量轉移等，這些技術能隱藏“噪音”，平均計算GPCR二聚體的潛在差異和異常，衡量其不同物理或化學狀態，但這些方法也隱藏了“噪音”中所含有的有價值信息，失去關于生物異質性的有用數據。如用于表達GPCRs的細胞，盡管培養的細胞具有遺傳一致性，但本質上成分仍是異質的，這種異質性在物種進化上是非常重要的，能使生物體在波動的環境中迅速適應，給生物體帶來生物優勢，最終生存下來。但這些方法需要較高的受體表達水平，受體過表達可能改變生理特性，引起不依賴配體的受體激活等。相比較而言，單分子技術提供了一個直接的窗口，并能克服樣品同步性的需求，通過記錄受體復合物的熒光強度或追蹤隨著時間變化的運動軌跡，更詳細和系統地研究細胞膜上GPCR二聚體的亞單位組成、軌跡均方位移、擴散系數等，從而揭示罕見的中間狀態和隱藏的動力學途徑[2]，這些是GPCRs實現不同的新功能和多種生理功能所必需的基礎，也是藥物設計的重要靶點。本文將對研究GPCR二聚化的單分子技術進行簡要綜述。

1 GPCR二聚體在藥理學方面的重大潛力

傳統觀點認為，GPCRs的信號通路是線性的，即正位激動劑與受體的正位作用位點結合，激活G蛋白，引起一系列下游信號轉導反應，但是由于正位作用位點保守性很強，正位激動劑與其結合的親和力較大，因此目前很難對正位激動劑進行新藥開發。近幾十年，研究人員將目光轉向了一種新作用位點——別構位點，別構調節劑與受體的別構位點結合，使受體構象發生變化，導致與該受體相互作用的蛋白功能改變，別構位點的出現不會影響正位激動劑與正位作用位點的結合，反而會調節正位激動劑的藥理學作用。研究發現，在GPCR二聚化中，一個受體被刺激后，通過別構調節，調節另一個受體的正位配體的藥理學特性，從而改變下游信號傳導，如AT1R-B2R異源二聚化可增加AT1R對AngⅡ的反應性，這對先兆子癇綜合癥的發生起關鍵作用[3]。在GPCRs中，結構不對稱會引起空間限制，影響信號復合體的排列，并最終在變構功能中發揮作用。單粒子追蹤方法顯示，A1/A2AR異源二聚體以菱形排列，這種不對稱結構對下游信號和功能具有重大影響。最近的一項研究發現，在Ghrelin受體和多巴胺D2受體(dopamine D2receptor，D2R)形成異源二聚體中，Ghrelin受體作為變構調節劑，而不是信號受體，明顯改變D2R的信號[4]，該結果可以解釋異源二聚體在標準藥物篩選中很難檢測到的原因，其中一個受體可能只是另一個受體的變構調節劑，而不是作為信號受體傳遞自己的信號。

GPCR二聚體具有非常大的藥物潛力，因此備受關注，其藥理學作用也越來越受到重視。阿片類受體二聚體的藥理學作用已被證明，研究發現，阿片受體的激動劑6′-Guanidinonaltrindole(GNTI)不能單獨激活κ阿片受體(κ opioid receptor，κOR)或δOR，卻能選擇性地激活κOR-δOR異源二聚體，異源二聚體的組織特異性強，能夠降低藥物的副作用，將6′-GNTI注射到老鼠脊髓內可以觀察到鎮痛作用，所以κOR-δOR異源二聚體的研究有利于鎮痛藥的研發[5]。目前，作用于κOR-δOR異源二聚體的二價配體藥物也在被研發，提供了潛在的新療法。二價配體包含了通過間隔連接的κOR選擇性拮抗劑5′-GNTI和δOR選擇性拮抗劑納曲吲哚(naltrindole)[6]。眾所周知，α1腎上腺素能受體(α1adrenergic receptor，α1AR)能夠調節血管功能，在臨床上可以靶向控制血壓。最近研究表明，CXCR4的跨膜肽TMD2能夠阻斷CXCR4-α1AR二聚體的形成，從而抑制α1AR對血管平滑肌收縮作用[7]。靶向GPCR二聚體的藥物有望能夠治療多種疾病，雖然目前取得的成果不多，但隨著GPCR二聚體知識的不斷增長，會取得更多的成果。

2 GPCR二聚體的時空動態新型檢測法——單分子技術

2.1 全內反射熒光顯微技術(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)對于所有分子來說，必須先通過細胞膜才能進出細胞，因此，在細胞膜上或附近發生著許多生物學過程。傳統的顯微鏡技術(如熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等)很難對這些過程進行成像，但TIRFM能夠分析活細胞膜附近一些分子的定位情況和動力學過程，如膜蛋白定位、胞吞過程等。其原理是當一束光從光密介質進入光疏介質時，根據斯涅耳定律，一部分光會發生折射，而一部分光會發生反射，當入射角不斷增大，折射角也會不斷增大，當折射角剛好達到90度時，就發生了全反射現象。全反射發生后，光波不會被反射回第一介質，由于光的波粒二相性，其中一部分能量會進入折射率較小的介質，沿著折射面傳播，這部分光我們稱為隱失波，其能量在Z軸上呈指數衰減(Fig 1A)。因此，隱失波在照明樣品時，僅激發樣本表面薄層范圍內的熒光基團，同時減弱來自胞內區域的熒光，使顯微成像在Z軸上的空間分辨率得到明顯改善，Z軸分辨率可達40～150 nm，大大提高了圖像的信噪比[8]。

TIRFM能夠提供納米級的分辨率和極快速的成像，用于微小結構和單分子成像，如細胞膜上單個蛋白質動力學研究、細胞結構成像等。目前，應用TIRFM從單分子層次對GPCR二聚體的結構與功能進行研究，發現N-甲酰肽受體(N-formyl peptide receptor，FPR)同源二聚體的解離和2D結合速率分別為11.0 s-1和3.1[copies/μm2]s-1，在1 s內，FPR就能完成單體和二聚體相互轉化的過程[9]。TIRFM與SNAP-tags技術聯合使用，發現β-AR二聚體(20.5 ℃)壽命約為4 s，比FPR二聚體(37 ℃)長約40倍，比毒蕈堿M1受體二聚體(23 ℃)長約6倍[10]。由于膜蛋白的連續和隨機運動，蛋白分子之間會發生隨機碰撞，因此要控制分子的表達水平。本課題組利用TIRFM發現APJ能以單體、同源二聚體和寡聚體的形式存在，且在顆粒密度小于0.3顆粒/μm2的情況下，單體、二聚體和寡聚體分別占有不同比例。另外，單個APJ之間存在瞬時相互作用，不斷形成和分解新的受體復合物[11](Fig 1B、1C)。

2.2 受激發射損耗(stimulated emission depletion, STED)顯微技術雖然傳統顯微鏡(如熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等)和TIRFM能夠解決生命科學領域的很多問題，但是衍射現象限制了他們的空間分辨率，衍射極限可用Abbe′s law量化[12]，公式如下：dx,y=λ/2NA；dz=2λ/NA2。dx,y指的是橫向分辨率，dz指的是縱向分辨率，λ為激發光波長，NA為顯微鏡物鏡的數值孔徑。根據公式，能夠清晰地計算出最高橫向分辨率為180 nm，最高縱向分辨率為500 nm。Hell等在1994年提出STED概念，于2014年獲得諾貝爾獎[13]。該技術能夠突破這種衍射極限，Z軸分辨率可達40～150 nm，具有很大的發展潛力。其原理是樣品被兩束激光以高強度脈沖形式照射，第1束激光(Exc beam)用于激發熒光分子，第2束激光(STED beam)用于損耗熒光分子，將熒光分子的周圍從受激狀態返回到基態。損耗激光的光路產生1個呈圓環型的能量分布，即圓環型的STED光，從而大大縮小有效的熒光檢測區域，使樣品發射熒光的體積限制在非常小的范圍內，只能檢測沒有完全損耗的熒光分子的中心，從而提高分辨率。這一技術可用于活細胞和固定樣品的成像，在一些生物學和醫學研究中發揮了重要作用，如細胞膜上和泡囊中蛋白質的分布與動態過程等。Van Laar等[14]利用STED，研究軸突內線粒體與內質網接觸部位處線粒體DNA的復制，發現在帕金森相關應激條件下，線粒體生物發生會根據解剖分區的方式不同而改變，有助于神經退行性疾病的治療。STED具有多種類型，如多色STED、脈沖STED、連續波[continuous-wave(CW)]STED和Gate STED等[15]。多色STED通過添加多個Exc beam和利用同一STED beam進行，激光束具有不同的激發光譜，但是具有相似的發射尾。脈沖STED使用脈沖式的激發光和損耗光，在短時間內發出大量的激發光，從而有效地將熒光分子周圍的熒光淬滅，提高空間分辨率。一般來說，激發光的脈沖比損耗光的脈沖要短，損耗光的脈沖比熒光分子的振動馳豫的時間要長，但是比熒光分子的壽命要短。脈沖STED的優點是損耗時只需相對較低的平均功率；而且，由于較低重復頻率的使用，熒光在被激發之前，在三重態馳豫中就能發出熒光，從而減少了光漂白[16]。另外，由于一些熒光的自發光能夠忽略掉脈沖激光，所以連續的激光仍在被使用，CW STED用連續激光(可見光和近紅外光)代替脈沖激光，降低了系統的復雜性(不需要脈沖光)和費用，增加系統的用途。CW STED中，熒光在激發狀態呆的時間越長，損耗光將該熒光從受激狀態返回到基態的可能性就越大，但是由于連續激光的峰強度較低，所以分辨率比脈沖STED的分辨率較低。為了解決這個問題，Gate STED應運而生，該技術將CW STED與時間門控檢測聯系起來，CW STED中，熒光分子被激活后，延遲一段時間后再收集熒光，那么淬滅熒光的相對概率將升高，原因是損耗光對熒光的耗損依賴于在激發態下熒光團暴露的光子數量，熒光光子在熒光團激發之后被收集，這就確保所收集的熒光源已經處于激發態至少一段時間。而時間門控可以忽略掉早期熒光的發射光子，激發熒光和收集熒光之間延遲的時間越長，越可以確保記錄的主要是熒光中心的熒光團，有效空間分辨率越高(Tab 1)。

Fig1AssessmentofGPCRdimerwithTIRFMA:Principle of TIRFM. n1(refractive index of the sample) is less than n2(refractive index of the cover slip). The excitation beam enters from the left at incidence angle(θ), which is greater than the critical angle c(θc). The excitation beam is reflected off the cover-slip-sample interface and an evanescent field is generated on the opposite side of the interface in the sample. Only fluorophores in the evanescent field are excited, as indicated by the green particles; B: TIRFM image of cells expressing APJ-GFP; C: Single-molecule co-tracking of APJ homodimers by TIRFM.

2.3 單分子定位顯微技術單分子定位顯微技術，如基態耗盡顯微術(ground state depletion，GSD)、光敏定位顯微術(photoactivatable localization microscopy，PALM) 和隨機光學重建顯微術(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，能連續激活和定位熒光，從而避免光的衍射極限，主要原理是熒光信號以單分子的形式被激活，通過函數擬合，計算出單分子熒光光斑的中央位點，經過上萬次循環的依次激活和計算，從而得出完整的超高分辨率圖像，分辨率高達10～75 nm。該類技術缺點是需要對批量圖片進行后處理算法，因而有可能產生假象。GSD通過減少同時發射熒光團的數目來克服衍射極限，成像速度為2～10 min/幅，高能激光激發熒光團標記的樣品，光子轟擊電子，增加“自旋翻轉”的概率，使熒光團由激發態進入三重態或“暗態”，在三重態中，熒光團不發射光子，樣品顯得更暗，有效地耗盡了基態，因此命名為“GSD”[17]。這些熒光團可以隨機地返回到基態，并且可以在返回到三重態之前，經歷激發到基態躍遷的多個光子發射，在任何給定時間內，單個熒光團發射的光子在空間和時間上與相鄰的熒光團不同。光子的爆發可以與高斯函數擬合，計算的質心對應于熒光團的位置，定位精度取決于透鏡的數值孔徑、激發光的波長和每個熒光團發射的光子數量[3]。GSD在任何時間只有一組熒光團主動發射，所以必須幾分鐘內收集數以千計的圖像，從而建立一個完整的定位圖，由于較長的采集時間與高功率激光，GSD更適合于固定的而不是活的樣品。

PALM與STORM的成像速度相同，均為5～20 min/幅，二者之間的主要差異是熒光激活和成像的順序，在PALM中，熒光被隨機激活，然后成像，再激活和成像，如此進行多個循環，直到檢測到目標分子的所有位置。而在STORM中，熒光激活和成像同時進行，能夠明顯提高數據收集的速度。PALM可用于單分子追蹤，在給定時間內激發一個或極少數的熒光團，使衍射極限區域不重疊，重復激發循環直到檢測到目標分子的所有位置，然后將其組裝到最終圖像中。目前，利用PALM發現，促黃體激素受體能預先形成同源二聚體和具有不同空間構型的寡聚體，改變寡聚體的不對稱性將調節信號的敏感性和強度[18]。

Tab1DifferencesbetweenSTEDandconfocalscanningmicroscope

2.4 結構照明顯微技術(structured illumination microscopy，SIM)SIM在乳腺癌細胞中檢測到雌激素受體(estrogen receptor，ER)能形成同源/異源二聚體，且占有比例不同，如ERα/α同源二聚體占有23.0%、 ERα/β2異源二聚體18.1%[19]。SIM以一系列具有高空間頻率的正弦條紋激光為光源，對樣品進行掃描，這種光源是激光穿過可移動光柵，并通過物鏡投射到樣品上產生的，顯微鏡光路中的柵格與衍射極限下的樣品結構圖像疊加會產生摩爾紋，當柵格處于不同相位和角度時，摩爾紋圖案也會發生變化，通過多張摩爾紋圖像的計算，把低頻信號轉變為高頻信號，重建成一個具有兩倍寬場分辨率的高分辨率圖像，橫向分辨率提高至100～130 nm，縱向分辨率提高至280～350 nm[20]。由于受限于多次柵格旋轉平移所需時間和曝光時間，SIM的成像速度小于1幅/s。

與其他超高分辨率技術相比，SIM有兩個突出優勢：首先，縱向分辨率的提高能明顯改善焦點失調問題，提高信噪比；其次，適用染料為常規熒光蛋白，沒有特定的性能要求，因此適用多色成像。在細胞生物學應用中，SIM的一個重要特征是可以使用標準染料和染色方法，通過光學切片在三個維度中同時成像多個細胞結構。但是SIM圖像為多幅圖片計算實現，很容易產生假象并容易引起光漂白，另外對球面像差敏感，在球面像差存在的條件下，照明圖像退化，因此，在較高頻率下獲得的信息量減少。在玻璃、透鏡浸沒介質和生物樣品之間折射率失配導致的球面像差中，很難觀察離蓋玻片較遠的區域。

2.5 單分子熒光共振能量轉移(single-molecule fluorescent resonance energy transfer，smFRET)FRET采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近(<10 nm)時，通過雙偶極反應，將光子從一個受激發的熒光團(供體)轉移到另一個熒光團(受體)。供體的放射光譜必須將受體的激發光譜重疊起來，適合FRET實驗的常用熒光團對為CFP/YFP、GFP/羅丹明和FITC/Cy3等。采用FRET可以解決光學顯微鏡分辨率限制的分子相對鄰近度問題，來顯示蛋白質間的相互作用、一個分子內部的結構變化等。當兩個染料發射波長相差很大時，采用敏化發射(sensitized emission，SE)FRET，要獲得FRET圖像，首先要先確定系數A和系數B，系數A主要指的是受體對FRET信號的干擾，系數B主要指的是供體對FRET信號的干擾。公式如下：Corrected FRET=RawFRET-(A×Acceptor)-(B×Donor)。本課題組利用SE FRET檢測到APJ-神經降壓素1型受體(neurotensin receptor type 1，NTSR1)異源二聚體的存在(Fig 2)，該二聚體能通過Gαq介導，增加ERK1/2磷酸化，促進細胞增殖[21]。當兩個染料發射波長相差很小，容易引起串色時，采用特定滲透FRET，公式如下：Corrected FRET=RawFRET-[(Acceptor-(Donor in Acceptor×Donor))×(Acceptor in FRET)]-[(Donor-(Acceptor in Donor×Acceptor) )-(Donor in FRET)]。

目前，在FRET基礎上又延伸出其他方法，如時間分辨FRET、光漂白FRET等，但是這些技術對GPCR二聚體的研究也是按總體平均水平進行的。smFRET可通過測量供體、受體熒光光強以及二者間的共振能量轉移效率，揭示標記位點間的距離[22]，常用熒光團對為Cy3/Cy5、Cy3B/ATTO 647N。激光激發目的蛋白上的供體熒光分子(Cy3)，供體熒光分子轉移部分能量到受體熒光分子(Cy5)，兩者發出的熒光經分光光路，分成中心波長在568 nm和675 nm的平行兩束，后被EM-CCD收集。供體與受體熒光點的信號分別成像于CCD視野的左右半區，實驗后，根據其坐標對應關系將來自同一被標記物上的供體與受體熒光點匹配。Dijkman等[23]利用smFRET發現，NTSR1能形成同源二聚體，且存在濃度依賴的瞬時相互作用，具有多個亞穩態交界面。

3 總結

目前觀察到的一些研究和臨床現象很難確定是否為受體二聚化的作用結果，但受體二聚化是能夠解釋這些現象的因素之一，如一些抗帕金森和抗精神病的藥物，被認為對GPCR單體具有特異性作用，但很可能對GPCR二聚體也具有特異性作用，所謂的“不純藥物”的脫靶效應可能是由于他們結合GPCR二聚體引起的。單分子技術為GPCR二聚體的研究提供了新的研究和藥物研發方向，結合不斷增長的GPCR二聚體結構方面的知識，將會獲取更多的成果。目前有將技術結合用于研究GPCR二聚體，如本課題組將TIRFM和BiFC結合起來，檢測到APJ能夠形成同源二聚體。多種技術的結合在GPCRs二聚體研究中發揮了重要作用，能從“時間、空間、動態、連續”檢測更多GPCRs之間的相互作用，這對于疾病發病機制的研究及新型藥物靶點的發現具有深遠意義[24]。

Fig 2 Assessment of APJ-NTSR1 heterodimer with SE FRET

HEK293 cells were cotransfected with pCFP-NTSR1 and/or pYFP-APJ. 24 h after transfection, and fluorescent images were acquired using MetaFluor 7.0 Software.