脈沖電磁場調控SREBP-1c及氧化應激改善db/db小鼠肝脂肪變性研究*

劉 穎，李遠轍，周聲毅，阮俊勇，羅二平，景 達，翟明明△

1.解放軍陸軍防化學院(北京 100113)；2.空軍軍醫大學軍事生物醫學工程學系(西安 710032)

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前我國第一大慢性肝病，已成為備受關注的公共衛生問題[1]。NAFLD的早期癥狀為異常肝臟脂肪堆積，15%～20%的病人會進展成為更嚴重的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。NASH表現為胰島素抵抗和氧化應激等，導致肝細胞膨脹、凋亡和肝星狀細胞活化，增加了肝硬化和肝癌的風險[2]。目前，NAFLD尚無公認特效治療藥物,因此尋找針對NAFLD及相關肝脂肪代謝的有效治療手段具有重要臨床意義。

低頻脈沖電磁場(Pulsed electromagnetic fields，PEMF)作為一種安全的、非侵入式治療手段被FDA所批準，其生物學效應也被用于肝臟研究。Ottani等對肝部分切除術后大鼠施加PEMF，促進了肝再生[3]。崔紅等對db/db小鼠施加PEMF刺激后，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)得到明顯改善，并且減輕了肝脂肪變[4]。雖然已經發現PEMF改善肝臟脂肪變性及IR的積極效果，但具體機制尚不明確。

IR發生機制雖然尚未完全闡明，但目前的研究認為氧化應激是其誘因[5-6]。氧化應激是由過度產生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)引起的，主要是在線粒體氧化磷酸化過程中產生。作為營養代謝的中心，肝臟富含線粒體，因此易受ROS攻擊[7]。通常血糖代謝由多種激素調節以保持動態平衡，而肝臟是這些激素作用的主要目標，在糖酵解和葡聚糖生成中起到主要作用。眾多激素中，只有胰島素可以降低血糖，一旦肝臟對胰島素產生抵抗，血糖控制將出現問題，常伴隨肥胖、糖尿病等其它改變。大量研究表明，抗氧化手段可以有效改善IR的發生、發展。

固醇調節元件結合蛋白1 (Sterol regulatory element-binding proteins 1，SREBP-1)是調控脂質代謝的關鍵轉錄因子，在 NAFLD 患者肝組織中過度表達，引起肝臟脂肪堆積[8]。SREBP-1c作為核轉錄因子 SREBP-1的亞型，參與調控葡萄糖代謝、脂肪酸及脂質合成。動物實驗及臨床研究均發現，SREBP-1c在體內異常過度表達，會誘導脂肪合成上調，導致肝臟等脂質堆積。當SREBP-1c 表達下調，可以改善肝細胞脂質代謝失衡[9]。然而，SREBP-1c是否介導PEMF改善NAFLD肝臟脂肪變性尚不明確。

本研究使用脈沖波形PEMF作用于NAFLD模型小鼠，以探究其改善db/db小鼠肝脂肪變性的潛在機制。

材料與方法

1 主要試劑 二奎琳甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司?？贵w均購自Santa公司。胰島素ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。血糖試紙購自Roche。甘油三酯(Triglyceride，TG)、丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、還原性谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH) /氧化型谷胱甘肽(Oxidized GSH，GSSG)定量試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

2 實驗動物 動物實驗獲得空軍軍醫大學動物倫理委員會批準。8只8周齡雌性C57BL/KsJ 小鼠(18.07 ± 1.54) g和16只8周齡雌性 C57L/6J db/db小鼠(29.73 ± 2.27) g購自南京大學。動物在標準環境下飼養：12 h/12 h明暗交替，溫度調節(22±1)℃，自由攝食、水。

3 實驗方法

3.1 實驗分組與處理：對照組由8只C57BL/KsJ小鼠組成；將16只 C57BL/6J db/db小鼠隨機平均分為NAFLD組及PEMF組。NAFLD組模型小鼠不加任何處理，PEMF組模型小鼠每天施加1 h刺激(PEMF頻率為15.38 Hz，場強為20 Gs，持續12 周)。

3.2 胰島素抵抗評價：小鼠禁食過夜后，取尾尖靜脈血檢測空腹血糖。實驗動物處死前用乙醚麻醉，摘眼球取全血，并在37℃靜置2 h后進行570 g離心10 min，取上清。按照胰島素ELISA試劑盒說明對血清胰島素含量進行測定。按照公式：

計算穩態模型的胰島素抵抗指數。

3.3 油紅O染色：10 μm冰凍肝臟切片在20℃進行油紅O染色10 min，經磷酸鹽緩沖液漂洗后置于Olympus光學顯微鏡下觀察脂質堆積。

3.4 甘油三酯測定：按照說明書，取100 mg肝組織樣本在0.9 ml無水乙醇中進行冰浴勻漿，然后570 g離心10 min，取上清，進行甘油三酯檢測。

3.5 抗氧化酶活性檢測：按照說明書，取100 mg肝組織樣本在0.9 ml 生理鹽水(0.9%)中進行冰浴勻漿570 g離心10 min后取上清檢測MDA。GSH/GSSG的檢測嚴格按照說明書中操作。

3.6 蛋白印跡：肝臟組織樣本使用RIPA裂解液在冰上進行裂解30 min，然后進行20000 g離心，取上清，使用BCA蛋白檢測試劑盒進行定量。蛋白樣品加入上樣緩沖液后，95℃加熱5 min進行變性處理，然后按照常規SDS-PAGE方法進行檢測。蛋白條帶采用Quantity One軟件進行定量。β-actin作為內參蛋白。

結 果

1 PEMF改善模型小鼠的胰島素抵抗 對照組小鼠空腹血糖為(4.10±0.18)mmol/L，血清胰島素為(10.80±1.08)mIU/L，HOMA-IR為2.13±0.22；NAFLD組db/db小鼠空腹血糖為(30.22±1.18)mmol/L，血清胰島素為(6.90±0.30)mIU/L，HOMA-IR為(6.97±0.32)；經PEMF干預后，db/db鼠空腹血糖為(22.9±2.18)mmol/L，空腹血清胰島素(3.53±0.65)mIU/L，HOMA-IR(4.01±0.54)。PEMF組較NAFLD組胰島素抵抗明顯改善(圖1)。

2 PEMF緩解模型小鼠肝氧化應激 與NAFLD組相比，PEMF組MDA及GSSG水平顯著下降，而GSH與GSH-Px水平明顯上升(圖2)。

3 PEMF減少肝脂質堆積 油紅O染色在40倍鏡下觀察結果顯示，PEMF組脂滴數量和大小均顯著降低(圖3 A)。PEMF組SREBP-1c的蛋白表達量較NAFLD組減少約35%左右(圖3 B)。除此之外，肝臟TG含量PEMF組降低至(4.49±0.86) mmol/gprot，而NAFLD組含量為(7.60±0.21) mmol/gprot(圖3C)。

圖1 PEMF改善NAFLD模型小鼠的胰島素抵抗(與對照組相比，*P<0.05；與NAFLD組相比，#P<0.05)

圖2 PEMF改善NAFLD模型小鼠的氧化還原穩態(與對照組相比，*P<0.05；與NAFLD組相比，#P<0.05)

圖3 PEMF改善NAFLD模型小鼠肝脂質堆積[A：冰凍切片油紅O染色 (×40)；B：SREBP-1c蛋白表達；C：肝臟三酰甘油含量]

討 論

當前我國肥胖和代謝綜合征患病率增長迅速，NAFLD的患病率已超過西方國家，成為我國肝、代謝領域的新挑戰，對全民健康構成嚴重威脅[10]。2型糖尿病并發NAFLD存在著顯著的胰島素抵抗[11]。因此迫切需要尋找到有效的、公認的治療方法，用以預防和治療NAFLD。PEMF作為安全、非侵入式物理手段已經被廣泛用在臨床治療骨愈合等疾病[12]?；赑EMF的積極生物學效應，本研究驗證了PEMF改善db/db小鼠肝脂肪變性的作用，并對潛在分子機制進行了探究。

2018年更新的《非酒精性脂肪性肝病防治指南》中指出，治療NAFLD的首要目標為減肥和改善胰島素抵抗。NAFLD與胰島素抵抗密切相關，伴隨有過量的游離脂肪酸在肝臟轉換為TG儲存，導致脂肪變性[10]。本研究對模型小鼠施加外源性物理刺激后，模型小鼠的空腹血清胰島素水平、HOMA-IR指標均顯著降低，驗證了PEMF對胰島素抵抗的積極作用。目前已有體外實驗證明過氧化氫會誘發3T3-L1細胞IR[13]。Zucker大鼠的體內實驗也證明了這點[14]。人體研究表明高脂飲食會增加線粒體過氧化氫生成和IR[6，15]。當對嚙齒動物采用線粒體靶向抗氧化劑干預或過度表達過氧化氫酶時，能有效改善高脂飲食引起的IR[15]。氧化應激目前被認為是NAFLD發病機制的關鍵因素，活性氧的產量增加導致脂質過氧化反應。為了探究PEMF改善模型小鼠IR是否與氧化應激相關聯，本研究檢測發現，與NAFLD組相比較，PEMF組的MDA下調，而GSH與GSH-Px水平明顯上升，GSSG水平顯著下降。MDA是氧化應激相關指標，肝臟MDA形成與過氧化脂質常被作為肝組織損傷和氧化損傷的生物標志。MDA是脂質過氧化作用的產物，最終能被降解，進而改變細胞和細胞膜的生物功能，其下調表明氧化應激減弱。此外，脂質在肝臟堆積經常加速MDA的釋放，這就導致核線粒體DNA的損傷以及活性氧誘導的細胞凋亡。GSH是一種重要的非酶的抗氧化劑，上調起到避免氧化應激損傷的作用；GSH-Px是一種廣泛分布在體內的重要酶，可代謝毒性過氧化物，如過氧化氫和脂質水解過氧化物，進入非毒性的羥基化合物中，利用GSH作為一種共同底物合成GSSG，以保護細胞的結構和功能，防止過氧化物的干擾和損傷?？傊?，PEMF通過上調GSH-Px表達提高總抗氧化酶的活性，通過上調GSH表達提高抗氧化能力，進而弱化了db/db小鼠肝臟的氧化應激，MDA的下調印證了PEMF保護肝臟避免氧化應激損傷。

SREBP-1c是肝臟內調節脂肪新生的重要的轉錄因子，它專門調控脂肪酸生物合成途徑中多種關鍵酶的表達。SREBP-1c在db/db小鼠體內表達水平升高，經組織學確診為NAFLD的患者體內也同樣表達水平升高。已有研究發現當大鼠的胰島素分泌受到破壞，SREBP-1c水平降低，注射胰島素后，SREBP-1c表達上調。SREBP-1c介導胰島素對脂質合成的調控，在新脂質合成中具有重要作用[16]。而在轉基因小鼠肝臟過表達SREBP-1c會誘發脂肪肝，增加TG含量，脂質過量合成堆積。Guo等的研究發現有氧運動訓練通過顯著下調SREBP-1c表達來改善脂肪肝[17]。本研究的結果也發現：PEMF組較NAFLD組下調SREBP-1c蛋白表達，并且肝臟TG含量顯著降低，肝臟脂滴數量和大小均得到了顯著改善。預示PEMF通過下調SREBP-1c表達，進而調節TG的合成，減少肝臟內新脂質的合成，改善肝臟的脂質合成堆積。

綜上所述，本研究的結果預示PEMF可能通過提高db/db小鼠肝臟的抗氧化能力，改善胰島素抵抗，從而降低了血清胰島素含量，進而下調SREBP-1c表達，調節肝臟TG和脂質的合成，緩解肝脂肪變性。