雙抗原夾心法和間接法檢測丙型肝炎病毒抗體對比研究*

孫 強，李艷琴，何寶明

陜西省漢中市中心醫院檢驗科 (漢中 723000)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是在世界范圍內廣泛分布的傳染性疾病，衛生組織統計顯示全球感染者數量約1.85億，感染率2.8%，且每年約35萬人因此發生死亡，亞太地區HCV患病率為0.1%～4.7%，其中我國丙型肝炎患者數量最多，共計約1000萬人[1-3]。隨著病情進展，約一半HCV感染者可逐漸轉變為慢性肝炎甚至引起肝硬化或肝細胞癌，我國HCV主要傳播途徑為血液和血制品，抗-HCV抗體檢測是目前早期診斷和血液篩查主要手段，不僅有利于切斷輸血傳播途徑和保障臨床用血安全，還可加強HCV感染者早期防治，故加強檢測質量管理極為重要[4-5]。酶聯免疫吸附試驗(Enayme liked immunosorbent assay，ELISA)、化學發光法及時間分辨熒光免疫分析法等均是抗HCV檢測常用方法且多采用間接ELISA法，但因抗原制備和試劑生產工藝影響，常存在假陽性和漏檢等局限性，雙抗原夾心法是以酶標記抗原代替間接法中酶標記二抗的檢測方法，可檢測包括IgG和IgM在內的總抗體，近年來在乙肝抗體、梅毒抗體及HIV抗體中均成功應用[6-9]。本文主要研究雙抗原夾心法和間接法檢測丙型肝炎病毒抗體的結果，為尋找更為準確有效的檢測方法提供依據。

資料與方法

1 研究對象 選取2018年4月至2019年4月我院輸血前、術前及孕前擬行HCV抗體檢測的患者1674例，其中男性851例(50.84%)，女性823例(49.16%)，年齡18～94歲，平均(52.71±13.06)歲。

2 試劑和儀器 addcare ELISA 1100全自動酶免分析系統(山東煙臺生物科技有限公司)；Genesis RSP150加樣系統(瑞士TECEN公司)；北京拓普DEM-3洗板機；間接法ELISA診斷試劑盒(上?？迫A，生產批號為201709422；英科新創，批號為2016047583)；雙抗原夾心ELISA試劑(北京萬泰，批號為CS20150928)，所有試劑盒均經衛生部門檢驗合格且在有效期內。且均在有效期內使用。

3 研究方法

3.1 樣本采集：采用促凝管取患者空腹肘靜脈血5 ml，以3000 r/min離心10 min后取上清分裝于無熱源的EP管中-20℃保存。

3.2 精密度驗證：取高、中、低三個濃度樣本重復檢測20次(孔)并計算吸光度值/臨界值(S/CO)均值、標準差及批內變異系數；另取高、中、低三個濃度樣本檢測單孔，重復檢測20 d并計算S/CO均值、標準差及批間變異系數。

3.3 檢測原理：①間接ELISA法：提前將HCV抗原肽片段包被于聚苯乙烯微孔板微孔板，實驗時向微孔中分別加入樣本，其中的抗-HCV抗體會與相應抗原結合，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素為示蹤劑，充分洗滌后加入3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)顯色，TMB在HRP酶催化下顯示為藍色，繼而酸化成黃色，且顏色的深淺與樣本中抗-HCV抗體濃度呈正相關性，采用用酶標儀在450 nm處測定S/CO即可計算樣品濃度。②雙抗原夾心ELISA法：用純化抗-HCV抗體包被微孔板，然后向包被單抗的微孔中依次加入HCV抗原肽片段，再與HRP標記的HCV抗原結合，形成抗原-抗體-酶標抗原復合物，經徹底洗滌后加入TMB顯色，先HRP酶催化下轉化成藍色，最終在酸的作用下轉化成黃色，且顏色深淺與樣品中抗-HCV抗體表達水平呈正相關，用酶標儀在450 nm波長下測定S/CO并計算樣品濃度。

3.4 檢測過程：將所有試劑和樣本緩慢恢復至室溫(18～25℃)，設置7個標準樣品孔，分別加入100μl按比例稀釋的不同標品，零孔中加100 μl標準品，其它孔中加入100 μl檢測樣品，酶標板加上覆膜后37℃反應2 h，去液并甩干后再向各孔加檢測溶液1工作液100 μl，在相同條件下反應1 h，甩干孔內液體并用350 μl洗滌液浸泡1～2 min后進行充分洗滌3次，最后1次洗滌時需將孔內洗滌液完全甩干，完成后每孔加檢測溶液2工作液100 μl，酶標板加上覆膜后在37℃下反應30 min，之后重復甩干、洗板5次，再向各孔加入90 μl底物溶液，酶標板加上覆膜后在37℃下避光顯色反應，充分顯色后所有孔加入終止液50 μl終止反應。確認酶標板底無水滴且孔內無氣泡后立即在450 nm波長用酶標儀測量各孔S/CO值即為抗-HCV抗體表達水平。

3.5 確證實驗：三種檢測試劑種任意兩種陽性為陽性，單一試劑陽性者進行核酸檢測(NAT)陽性為陽性，否則均為陰性，計算間接ELISA法和雙抗原夾心ELISA法對HCV檢出率并比較兩種檢測方法靈敏度和特異度。

結 果

1 三種試劑對HCV檢測結果比較 上?？迫A間接法、英科新創間接法和北京萬泰雙抗原夾心法HCV檢出率分別為4.30%、4.06%和3.52%(P>0.05)，三種檢測試劑S/CO比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 三種試劑對HCV檢測結果比較

2 間接ELISA法診斷準確性 以確證實驗結果為“金標準”，間接ELISA法檢測HCV靈敏度為94.00%，特異度為98.27%，陽性預測值為62.67%，陰性預測值為99.81%，準確率為98.15%，一致性Kappa為0.743。

表2 間接ELISA法診斷準確性分析(例)

3 雙抗原夾心ELISA法診斷準確性 以確證實驗結果為“金標準”，雙抗原夾心ELISA法檢測HCV靈敏度為97.91%，特異度為99.26%，陽性預測值為79.66%，陰性預測值為99.94%，準確率為99.22%，一致性Kappa為0.875。

表3 雙抗原夾心ELISA法診斷準確性分析(例)

4 間接法和雙抗原夾心法檢測HCV一致性 McNemar檢驗結果顯示，間接法和雙抗原夾心法檢測HCV結果差異有統計學意義(χ2=6.095，P<0.05)。

表4 間接法和雙抗原夾心法檢測HCV一致性分析(例)

討 論

早期HCV感染常缺少典型癥狀，容易在不知情下通過手術或獻血等途徑造成傳播和感染，對人類健康造成巨大危害，因此輸血前、術前和孕前HCV檢測已在各級醫院普遍展開，目前臨床常用檢測方法包括核酸擴增試驗法、化學發光法以ELISA法等[10]。由于HCV基因序列突變而導致編碼的氨基酸序列大幅度改變，且國內感染者常為多種基因系HCV混合感染，導致核酸擴增試驗早期診斷效果欠佳；化學發光法敏感性及特異性較高且檢測速度快，但成本偏高，難以作為常規檢測方法開展[11-12]。

ELISA法對HCV抗體檢出率可達99.0%，其中間接ELISA法是目前國內外抗-HCV抗體檢測應用最廣泛的方法，但容易受污染出現假陽性，且采用間接法原理檢測的ELISA診斷試劑盒為人工合成或基因工程制造的固相多肽抗原，檢測結果常因生產廠商不同而存在明顯差異[13-14]。我國《血站操作技術規程》規必須采用兩家ELISA抗體診斷試劑對獻血者進行篩查，目前常用抗原包括HCV-core、NS3、NS4及NS5等，但由于間接法本身的局限性導致仍難以完全避免假陽性和漏檢發生，為避免血液資源浪費和防止HCV經輸血傳播，尋找更為準確有效的HCV篩查方法勢在必行[15-16]。隨著丙型肝炎重組抗原技術進步，雙抗原夾心法作為新型檢測手段近年來也逐漸推廣，雖然與間接法基本原理均為免疫性診斷，但檢測過程和所用試劑盒不同[17]。本研究比較兩種檢測方法三種ELISA診斷試劑對HCV檢出率顯示，上?？迫A間接法、英科新創間接法和北京萬泰雙抗原夾心法檢出率分別為4.30%、4.06%和3.52%且三種檢測試劑S/CO無明顯差異，表明不同試劑對HCV檢出率基本相同，但由于假陽性和假陰性存在，此結果尚不足以判斷各種試劑優劣。

間接ELISA法采用HRP標記抗-IgG抗體為第二抗體酶結合物，因血清中IgG產生的時間相對較晚，故而用于HCV早期篩查和診斷存在一定漏檢可能性，同時由于部分非特異性物質吸附，檢測結果又可能產生假陽性[18]。隨著基因工程應用和生產工藝改進，ELISA診斷試劑盒質量不斷提升，但由于窗口期和患者免疫功能影響，仍難以完全避免漏檢情況發生[19]。與間接ELISA法相比，雙抗原夾心ELISA法檢測抗-HCV抗體包括IgG和IgM的總抗體，且反應時不受IgG亞型影響，有利于縮短HCV感染“窗口期”，提升早期感染患者檢出率，同時雙抗原夾心法采用兩種重組抗原分別標記生物素及吖啶酯，可有效減少類風濕因子及非特異抗體的干擾，從而減少假陽性產生[20]。陜柏峰[21]等研究顯示雙抗原夾心ELISA法檢測HCV結果與確證實驗符合率達96.60%，假陽性率較間接法明顯降低且稀釋實驗理論檢測下限≥0.007NCU/ml。周齊洋等[20]研究認為雙抗原夾心ELISA法特異性和早期感染監測能力明顯優于間接ELISA法，因此有望成為HCV檢測主要方法。本研究結果顯示，間接法和雙抗原夾心法用于HCV檢測靈敏度分別為94.00%和97.91%，特異度為分別為98.27%和99.26%，陽性預測值分別為62.67%為79.66%，陰性預測值分別為99.81%和99.94%，準確率分別為98.15%和99.22%，一致性Kappa為0.743和0.875，可見雙抗原夾心ELISA法在靈敏度和特異度方面均具有一定優勢，診斷準確率較間接法明顯提升，用于早期感染診斷可有效避免漏診或誤診，對及時干預和改善患者預后具有重要意義。周奕等[22]對198例慢性丙型肝炎患者臨床資料進行研究顯示，HCV感染途徑包括輸血、靜脈藥癮和性接觸等，且輸血為主要傳播方式。因此雙抗原夾心ELISA法用于血液樣品篩查則有利于減少漏檢和假陽性，及避免血液資源浪費，又可有效控制HCV經輸血途徑傳播，從而降低感染率和控制疾病流行。此外本研究采用McNemar檢驗比較雙抗原夾心ELISA法和間接ELISA法對HCV檢出率一致性顯示，兩者差異有統計學意義，表明雙抗原夾心法用于HCV檢測較間接法具有較大優勢，可明顯提升HCV早期篩查和診斷準確性。

綜上所述，雙抗原夾心ELISA法用于HCV檢測靈敏度和特異度均明顯高于間接ELISA法，對控制HCV感染和傳播具有較高臨床價值和應用前景。