糖蜜對草魚混養池塘水質和細菌群落結構的影響

郭小澤，唐艷強，侯玉潔，劉文舒，陳彥良，方 劉，肖海紅，李思明

( 1.江西省農業科學院 畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200； 2.南昌市農業科學院，江西 南昌 330008；3.長江大學 動物科學學院，湖北 荊州 434023 )

隨著我國水產養殖業規?；?、集約化的發展，養殖水體的水質處理技術成為水產養殖業研究的熱點。研究表明，水產養殖動物只能有效吸收投喂飼料中蛋白質的20%～25%，其余部分則以殘餌、氨氮和糞便的形式排放到養殖水體中[1]。在高溫季節，隨著人工飼料投喂量的增加，養殖水體中氨氮、亞硝酸鹽氮的含量會逐漸升高，從而導致養殖動物發病或死亡[2]。因此，集約化養殖條件下，有效解決養殖水體水質問題成為水產養殖業健康發展的重要因素之一。

生物絮團技術(BFT)是通過在養殖系統中培育和調控微生物群落來促進養殖動物健康生長，是一種將水處理系統和養殖生長系統有機結合的新型人工綜合生態技術[3]。該技術通過微生物群落吸收、轉化水體中的氮磷代謝廢物，達到維持水體水質穩定的作用。同時，形成的生物絮團可作為部分養殖動物的天然餌料，節約了養殖成本。該技術的核心是通過調節水體的C/N來控制生物絮團的形成， Avnimelech[4]通過建立假設模型，根據微生物自身蛋白合成對C/N需求，計算得出飼料中C/N為15.75∶1時有利于異養菌的繁殖，可有效降低水體中氨氮和亞硝酸鹽氮含量。隨后，C/N對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[5]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[6]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[7]、鯽魚(Carassiusauratus)[8]等養殖水質的影響及生物絮團調控方面的研究均有報道。

目前，生物絮團技術在集約化水產養殖中作為一種改善養殖水體環境的手段得到了廣泛的研究和應用，但該技術的研究更多集中于蝦和羅非魚等單一養殖模式中，對其在混養模式及其水體中細菌群落結構的研究還較少。筆者利用細菌16S rRNA測序技術，分析通過投放糖蜜調控水體C/N水平對草魚(Ctenopharyngodonidellus)混養池塘水體細菌群落結構的影響，以期從水體微生物角度為C/N調控養殖水體水質技術提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗設置3個不同處理組，每組3個平行，各處理組通過添加糖蜜調控C/N水平，分別為15∶1、20∶1、25∶1，以不投放糖蜜組為對照組(C/N為10∶1)。根據文獻[4]總結的生物絮團養殖系統的C/N調控公式，及飼料投喂量調整不同處理組糖蜜的添加量。糖蜜添加量按下式計算：

C/N=(m1×ρ1+m2×ρ2)/(m2×ρ3)

式中，m1為糖蜜添加量，ρ1為糖蜜中有機碳含量，m2為飼料投喂量，ρ2為飼料中有機碳含量，ρ3為飼料中氮含量。

試驗于12個25 m×25 m×2 m水泥護坡池塘中進行。每個池塘放養850尾草魚，體質量為(320.4±2.5) g；彭澤鯽(C.auratusvar.pengze)200尾，體質量為(45.3±1.2) g；鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)100尾，體質量為(86.7±4.3) g；鳙魚(Aristichthysnobilis)50尾，體質量為(98.4±4.8) g。上述魚苗均由九江市水產科學研究所提供。

1.2 試驗管理

試驗于2017年7月5日—10月5日在九江市水產科學研究所試驗基地進行。每日投喂飼料3次，分別為8:00—8:30、12:00—12:30和16:00—16:30，所有試驗使用粗蛋白含量為30%的草魚混養飼料(江西海大飼料有限公司)，每日定量投飼，日投量約為草魚體質量的3%，每周根據攝食和生長情況作適當調整。試驗期間所有池塘不換水，只補充因滲漏和蒸發而損失的水量，使水位維持在約1.5 m。同時，每日1:00—5:00及晴天13:00—15:00打開增氧機，并根據天氣情況調整。每次投喂飼料后1 h，將糖蜜與少量池塘水適時在桶中攪拌混合，全池均勻潑灑。

1.3 樣品采集與檢測

1.3.1 水質檢測

每月上旬選擇晴天，于10:00用采水器在池塘四周及中心5個固定點水深0.5 m處分別采集1 L水樣混合，置于無菌聚乙烯瓶中靜置30 min后，經800目篩絹過濾，冷藏帶回實驗室立即進行水質指標檢測。使用YSI-QS600水質監測儀現場檢測水體的溶解氧和pH；水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、總氮、總磷測定參照《水和廢水監測分析法》[9]進行。其中，氨氮質量濃度測定采用納氏試劑分光光度法，硝酸鹽氮質量濃度測定采用萘乙二胺分光光度法，硝酸鹽氮質量濃度測定采用紫外分光光度法，總氮和總磷采用過硫酸鉀氧化法檢測。

1.3.2 生物絮團指標的測定

生物絮團沉積量測定采用文獻[10]的方法，使用沉淀漏斗(1000-0010，Nalgene)取1 L水樣經過30 min的沉淀，統計生物絮團沉積量；總固體顆粒懸浮物測定采用CJ/T 52—1999《城市污水懸浮固體的測定》，取水樣1 L，使用TOYO定量濾紙抽濾，于105 ℃烘箱烘干后稱量質量。

1.3.3 水體細菌群落結構檢測

根據前期水質檢測結果，選取最佳糖蜜添加組和對照組進行水體中微生物菌群檢測。用采水器在水質取樣固定點采水3 L，經過0.22 μm的濾膜真空抽濾后，將濾膜置于無菌EP管中，并放置液氮中速凍，用于細菌DNA提取。細菌DNA提取使用土壤基因組DNA提取試劑盒(OMEGA，美國)進行。在超凈工作臺中，將采樣獲取的濾膜置于5 mL無菌EP離心管中，用滅菌后的剪刀將濾膜盡量剪碎，加入2.5 mL的 Buffer SLX Mlus。參照DNA提取試劑盒說明書進行操作提取DNA，將提取到的樣品DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將檢測合格的細菌DNA進行PCR擴增，擴增引物根據細菌16S rRNA的V3～V4區設計引物U341F/U806R。具體序列為：U341F，5′-CGGCAACGAGCGCAACCC-3′；U806R，5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′。擴增產物經檢測合格后進行純化及測序文庫構建，測序服務由北京諾禾致源科技股份有限公司提供。測序結果經過拼接、過濾得到Clean Tags，再經過嵌合體的去除得到有效數據,根據特定的閥值(97%)進行可操作分類單元聚類，并結合微生物數據庫——SILVA進行物種注釋和物種分類分析。

1.4 數據分析

測序結果的可操作分類單元聚類采用RDP classifier貝葉斯算法；利用Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數計算細菌生態多樣性指數；主成分分析利用R 3.1.0軟件進行。利用SPSS 19軟件對數據進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 潑灑糖蜜對草魚混養池塘水質指標的影響

潑灑糖蜜對草魚混養池塘水質指標的影響見表1。在試驗前期(7月)，各組的水質指標無顯著差異(P>0.05)。隨著試驗進行，潑灑糖蜜組的池塘水體中溶解氧水平較對照組有降低趨勢，尤其是C/N 20∶1組和C/N 25∶1組與對照組差異顯著(P<0.05)。各組池塘水體中總磷含量隨著試驗進行均逐漸升高，潑灑糖蜜組與對照組無顯著差異(P>0.05)。潑灑糖蜜后，水體中氮元素的變化主要表現為氨氮、亞硝酸鹽氮的含量下降，硝酸鹽氮的含量升高，其中C/N 20∶1組與對照組差異顯著(P<0.05)。

表1 潑灑糖蜜對草魚混養池塘水體水質指標的影響

注：同列中字母不同的平均值差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 潑灑糖蜜對草魚混養池塘生物絮團形成的影響

草魚混養池塘中潑灑糖蜜可顯著促進生物絮團的形成。在試驗前期(7月)，各組生物絮團沉積量和總固體顆粒懸浮物量無顯著差異(P>0.05)(圖1、圖2)。試驗組生物絮團沉積量和總固體顆粒懸浮物量隨糖蜜潑灑量的增加而升高，并且在8月達到最大值，隨后9月和10月開始降低，而對照組則無顯著變化。其中，8月、9月和10月C/N 20∶1組和C/N 25∶1組的生物絮團沉積量與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)；潑灑糖蜜的池塘水體中總固體顆粒懸浮物量在8月、9月和10月均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 潑灑糖蜜對草魚混養池塘水體中生物絮團沉積量的影響

圖2 潑灑糖蜜對草魚混養池塘水體中總固體顆粒懸浮物量的影響

2.3 潑灑糖蜜對草魚混養池塘細菌群落多樣性的影響

根據水質指標檢測結果，分別選取對照組和C/N 20∶1組進行水體細菌群落分析，結果見表2。通過測序后對各樣品的有效序列進行系譜分類，以97%相似性水平為標準劃分可操作分類單元，對照組-1、對照組-2、對照組-3組和C/N 20∶1-1、C/N 20∶1-2、C/N 20∶1-3組樣品數據分別可劃分為7210、7310、7636和6056、6369、5698個可操作分類單元。通過在同一樣本中檢測到的隨機選擇擴增子序列的覆蓋率評估抽樣的完整性發現，可操作分類單元的覆蓋率為93.23%～96.75%。根據樣品多樣性指數(Shannon指數和Simpson指數)可知，潑灑糖蜜組的草魚混養池塘水體中微生物多樣性高于對照組。然而，Chao1指數表明，潑灑糖蜜組草魚混養池塘水體菌群的豐度與對照組相比有所下降。

表2 各樣品多樣性指數

2.4 潑灑糖蜜對草魚混養池塘菌群結構的影響

通過對有效序列進行系譜分類，統計各個樣品中重要的細菌門類及其相對豐度，共獲得10個重要菌門(表3)，分別為藍細菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、梭桿菌門、綠菌門、糖桿菌門、厚壁菌門、酸桿菌門。統計結果表明，在門類水平上，C/N 20∶1組和對照組水體微生物中優勢菌門為藍細菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。其中，對照組藍細菌門相對豐度(32.34%～38.71%)高于C/N 20∶1組(20.17%～24.77%)，而C/N 20∶1組放線菌門(14.29%～17.01%)、綠彎菌門(4.33%～6.19%)和厚壁菌門(1.15%～1.48%)的相對豐度均高于對照組[放線菌門(7.84%～10.01%)、綠彎菌門(1.24%～1.75%)、厚壁菌門(0.18%～0.44%)]。

對篩選出的相對豐度較高的前10種微生物群落進行屬水平菌群結構及分布統計分析，對照組和C/N 20∶1組水體中的優勢菌屬均為聚球藻屬(Synechococcus)、CL500_29_marine_group和hgcI_clade(圖3)，但各優勢菌屬的相對豐度在不同組中變化卻不同。與對照組相比，C/N 20∶1組的聚球藻屬豐度有明顯的降低，而CL500_29_marine_group和hgcI_clade菌屬的豐度則明顯升高。

表3 草魚池塘水體中優勢細菌門類及相對豐度 %

圖3 樣品中優勢菌屬及其相對豐度

2.5 樣品聚類分析

通過對樣品進行主成分分析(圖4)發現，對照組和C/N 20∶1組的樣品分布在不同區域，說明在草魚混養池塘中潑灑糖蜜可有效改變水體中細菌群落的主成分。同時，為了研究樣品間的相似性，對樣品進行聚類分析(圖5)，構建樣品的聚類樹發現，對照組3個樣品和C/N 20∶1組3個樣品各自聚為一支，說明樣品的相似性較為接近。

圖4 細菌群落的主成分分析

圖5 樣品聚類樹

3 討 論

3.1 潑灑糖蜜對草魚混養池塘水質指標的影響

Avbimelech[4]提出了水產養殖系統中的C/N對水質調控的生物絮團反應機制理論，并在實際應用中有效降低了養殖水體中的氨氮及亞硝酸氮的含量。本研究以糖蜜為碳源調控草魚混養池塘水體中的C/N，結果表明，C/N為20∶1時對水體氨氮、亞硝酸鹽氮的含量降低效果最佳，說明草魚混養池塘水體C/N為20∶1時更適宜生物絮團異養細菌的生長繁殖，而C/N低于或高于這個比例則會抑制其生長繁殖，這與在養殖羅氏沼蝦池塘中潑灑糖蜜的試驗結果一致[11]。然而，王金林等[12]以葡萄糖為碳源調控草魚養殖水體的C/N，結果發現，C/N為25∶1時對水體氨氮、亞硝酸鹽氮的含量降低有顯著效果。這一差異可能與試驗所用碳源、草魚放養模式等因素有關，因為不同的碳源對水體生物絮團的營養成分、微生物菌群組成有影響[13]。

本研究結果發現，隨著水體中C/N逐漸升高，水體的溶解氧含量反而降低，這一現象在羅非魚[14]和凡納濱對蝦[15]的試驗中也有報道。溶解氧含量降低可能是由水體的生物絮團中異養細菌數量增加及積累的有機物增加而耗氧量增大所致[16]。因此，在應用生物絮團技術的過程中需要充分的曝氣，充足的氧氣有利于異養細菌的聚集，加速生物絮團的形成。同時，持續的曝氣可使絮團懸浮于水體中，有利于緩解絮團的沉淀[17]。

3.2 潑灑糖蜜對草魚混養池塘細菌群落多樣性的影響

環境中細菌群落多樣性是群落穩定性的重要衡量指標，菌群組成越復雜，說明菌群應對外部環境變化和群落內部種群波動的緩沖能力就越強，群落結構就越穩定。本研究中，以Shannon指數和Simpson指數為指標衡量水體中細菌群落多樣性。結果表明，潑灑糖蜜可提高草魚混養池塘細菌群落的多樣性。這與在蝦蟹混養系統中添加糖蜜對水體細菌群落多樣性的研究結果相似[18]。同時，有研究表明，當水體中C/N水平過高時，可能會抑制水體中敏感細菌的生長和繁殖，造成菌群多樣性降低[19]。本研究只檢測了C/N為20∶1時菌群多樣性的變化，故無法確定是否C/N水平升高會導致草魚混養池塘水體中菌群多樣性下降，這還需進一步的研究。

3.3 潑灑糖蜜對草魚混養池塘菌群結構組成的影響

細菌在養殖水體中物質和能量循環及轉化過程中具有重要的作用，細菌群落結構決定了水體環境生態功能的特性。本研究發現，草魚混養池塘水體中優勢菌群主要有藍細菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門，這與李建柱等[20]對草魚養殖池塘水體中菌群檢測結果基本一致。然而，王金林等[12]研究發現，草魚養殖水體中優勢菌群僅有變形菌、放線菌和擬桿菌。這一差異可能與養殖池塘、養殖魚類放養種類、檢測水樣季節及水樣采水位置等因素有關[21]。

本研究結果表明，潑灑糖蜜對草魚混養池塘水體中細菌群落結構有顯著的影響。藍細菌又稱藍藻，是一種分布廣泛的、古老的原核生物類型，在全球的碳氮循環中扮演著重要的角色[22]。在養殖池塘中，水華藍藻會通過釋放藻毒素對養殖生物造成傷害，還會對池塘生態系統微生態環境造成影響[23]。本研究中潑灑糖蜜的池塘水體中藍細菌門的相對豐度與對照組池塘相比有降低，說明通過C/N調節可有效控制草魚混養池塘水體中藍細菌的豐度。同時，本研究發現，潑灑糖蜜后，草魚混養池塘水體中放線菌門和綠彎菌門相對豐度升高。放線菌是一類廣泛分布于自然界的特殊菌種類型，因產生豐富的活性次生代謝產物(如抗生素、維生素和酶)而著名，其大量生長繁殖，能改善水體氣味并對水體有消毒作用，對病原微生物特別是對抑制腐敗細菌的生長繁殖有抑制作用，同時還具有轉化氮、磷等元素的功能[24]。綠彎菌是工廠廢水中常見的細菌，與化學耗氧量的去除有很好的相關性[25]。在優勢菌屬方面，本研究發現，潑灑糖蜜后草魚混養池塘水體中CL500_29_marine_group和hgcI_clade菌屬的豐度與對照組相比有一定比例的升高。有研究表明，hgcI_clade具有很強的吸收碳水化合物和富氮化合物的遺傳能力，并耐受較低溶解氧水平，還可利用低溫中的低含量的溶解有機碳[26]；而CL500_29_marine_group能夠有效利用多種形式的碳水化合物[27]，推測CL500_29_marine_group和hgcI_clade通過促進碳循環和氮循環來改善池塘水體的水質。由此可見，在草魚混養池塘水體中潑灑糖蜜可優化水體中細菌群落結構，有效改善水體生態環境。

3.4 潑灑糖蜜對草魚混養池塘菌群的聚類分析

多樣性的高低可以反映各群落物種組成的差異。利用距離表征出樣品間的關系，通過主成分分析作圖法將所有樣品在二維坐標系中表現出來，從側面反映了各個組的多樣性及各樣品之間的相互關系[28]，有助于分析各樣品的群落組成結構。樣品主成分分析表明，對照組和C/N 20∶1組的樣品各組分布在一側，說明在草魚混養池塘中潑灑糖蜜可有效改變水體中細菌群落的主成分結構。另外，利用加權UniFrac距離建立物種系統發育樹來分析微生物群落樣品間的相似性[29]，結果顯示，對照組和C/N 20∶1組的樣品各組分別聚為一支。這進一步證明，通過潑灑糖蜜來調節水體的C/N比分別為10∶1和20∶1可有效改變草魚混養池塘水體中微生物菌群的種類和豐度。

4 結 論

本研究結果表明，在草魚混養池塘中潑灑糖蜜調節水體C/N為20∶1時，可增加水體生物絮團沉積量，并優化水體細菌群落結構，顯著降低水體氨氮和亞硝酸態氮的含量，是一種改善草魚混養池塘水體水質的有效方法。