北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因多態性

易金鑫，代應貴，孫際佳，張浩然，劉 麗

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學，特種水產研究所，貴州 貴陽 550025； 3.華南農業大學 海洋學院，廣東 廣州 510642 )

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)屬鱸形目、麗鯛科、羅非魚屬，分布于非洲尼羅河流域。尼羅羅非魚自1976年作為優良品種被聯合國糧農組織推廣養殖以來，也是我國成功推廣的魚類引進養殖品種[1]。早在20世紀70年代末，珠江流域就開始了尼羅羅非魚的養殖，其中部分尼羅羅非魚個體自養殖區逃逸入侵河流并快速繁殖、擴散，在該流域建立了野生種群[2]。

外來種入侵是當今世界生物學研究的熱點問題之一[3-4]。外來種入侵到新的環境，需要克服各種生物及非生物屏障。在入侵過程中，外來種種群的建立、擴張要經歷自身的演變、適應、競爭和暴發[4]。大多數外來物種通過不同途徑侵入新區域時，初始種群通常是由原產地的少數個體繁衍而來，其遺傳多樣性可能比原產地的種群要低得多[4]，但也有少部分種群能克服種群奠基者效應，在入侵地建立穩定的種群[3]。研究表明，種群豐富的遺傳多樣性是外來種入侵成功的重要保證[5]。

線粒體DNA結構較為簡單，具有分子量小、嚴格遵循母系遺傳等特點，從而被廣泛用于種群遺傳學和系統進化研究[6]。細胞色素b(Cytb)基因是mtDNA上唯一的結構和功能被了解得較為清楚的蛋白編碼基因，進化速度適中，是研究群體遺傳結構的理想工具，也是魚類種群遺傳多樣性研究常用的標記之一[7]。

北盤江為珠江水系西江上游支流。由于受董箐電站大壩的阻隔，目前尼羅羅非魚在北盤江僅擴散分布于董箐電站大壩以下北盤江下游河段，并已成為該河段魚類優勢種群[8-9]。迄今為止，尚未見有關北盤江下游尼羅羅非魚野生群體遺傳多樣性的研究報道。筆者通過對北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因序列進行全序列測序，分析其序列變異及遺傳多樣性，闡述北盤江下游尼羅羅非魚群體遺傳多樣性，為評估該群體對北盤江下游河段的入侵適應能力提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年4月于貴州北盤江董箐電站大壩以下下游河段的董箐、白層、樂元、巖架4個采樣點(圖1)，共采集尼羅羅非魚38尾，體長106～252 mm，體質量47.4～576.4 g。每尾魚在背部取其肌肉約為2～3 g，以酒精固定，并于-20 ℃下保存備用。

圖1 北盤江下游尼羅羅非魚樣品采集點

1.2 Cytb基因擴增與測序

使用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒提取尼羅羅非魚mtDNA，并用1.00%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量和純度。尼羅羅非魚Cytb基因序列擴增以及測序的引物為：5′CTAATGACTTGAAAAACCACCG 3′，5′TTTGGGAGTTAGGGGTAAGGGT 3′。PCR擴增所得產物經過1.00%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選取有良好擴增條帶的PCR產物，送至上海生物工程有限公司進行純化及雙向測序。

1.3 數據處理

序列輸入BioEdit和Editseq軟件進行對比分析，輔以人工校對，并從GenBank獲取長度相同的同源序列校對DNA序列的一致性。運用Mega 5分別計算堿基及氨基酸含量、核苷酸序列差異，采用Dnasp計算遺傳多樣性參數。在GenBank下載莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)Cytb基因序列為外群(登錄號：AY597335.1)，根據Kimura雙參數法計算單倍型遺傳距離，構建尼羅羅非魚單倍型鄰接法及最大似然法系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 尼羅羅非魚Cytb基因序列變異

通過擴增、測序，并進行同源序列比對分析，獲得北盤江下游尼羅羅非魚群體長度為1135 bp的Cytb基因序列。

尼羅羅非魚Cytb基因序列中共計發現151個變異位點，每個變異位點分別含有1～19個試驗魚個體。這151個變異位點含116個轉換位點、32個顛換位點和3個轉換與顛換共存位點，轉換位點數明顯多于顛換位點數(表1)。其中，簡約信息位點為150個，單一變異位點為1個。在151個變異位點中，分布于密碼子第3位點的變異位點為最多、達134個，而分布在密碼子第1、2位點的變異位點分別只有16個、1個。

表1 北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因及密碼子堿基變異

2.2 尼羅羅非魚Cytb基因編碼氨基酸序列及變異

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因1135 bp序列共編碼了378個氨基酸。在這378個氨基酸組成的多肽序列中，以亮氨酸所占平均比例最高(16.33%)、色氨酸所占平均比例最低(0.41%)。該群體Cytb基因共有133個同義突變、9個非同義突變，同義突變顯著多于非同義突變(表2)。在由9個非同義突變引起的氨基酸變異中，第6位氨基酸變異較多，在單倍型6、12、13由賴氨酸(AAA)變成了谷氨酸(GAA)，在單倍型5、11由賴氨酸(AAA)變成谷氨酰胺(CAA)。第364位氨基酸由異亮氨酸(ATT)變成了纈氨酸(GTT)。第365位氨基酸由亮氨酸(CTC)變成了苯丙氨酸(TTC)。這3個位點氨基酸變異均由密碼子第1位點堿基突變所致。第360位氨基酸，因密碼子第2位點變異，導致其由苯丙氨酸(TTC)變成了絲氨酸(TCC)。密碼子第3位點突變所導致的變異發生在第125位氨基酸由異亮氨酸(ATA)變成了甲硫氨酸(ATG)以及第302、341位氨基酸由甲硫氨酸(ATG)變成異亮氨酸(ATA / ATT)。第303、320位氨基酸，因密碼子第1、3位點同時突變，分別由纈氨酸(GTT)變成了異亮氨酸(ATC)、由亮氨酸(CTA)變成了異亮氨酸(ATC)。

表2 北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb氨基酸變異位點

注：HAP1～14為第1～14單倍型；E.谷氨酸，I.異亮氨酸，K.賴氨酸，L.亮氨酸，M.甲硫氨酸，P.苯丙氨酸，Q.谷氨酰胺，S.絲氨酸，V.纈氨酸.

2.3 遺傳多樣性及遺傳距離

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共計發現了14個單倍型。單倍型之間的遺傳距離為0.0009～0.1479，平均遺傳距離為0.0781。單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數、平均核苷酸差異數分別為0.8634、0.0671、76.1679。

根據遺傳距離構建了北盤江下游尼羅羅非魚群體單倍型的鄰接法(圖2)、最大似然法(圖3)系統發育樹，兩種系統樹具有相似的拓撲結構。該系統樹顯示，北盤江下游尼羅羅非魚群體可分為2個分支，其中一個分支包含8個單倍型共19個個體，另外一個分支含有6個單倍型19個個體。

圖2 基于遺傳距離構建的北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因單倍型鄰接法系統發育樹

圖3 基于遺傳距離構建的北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因單倍型最大似然法系統發育樹

3 討 論

3.1 Cytb基因序列和密碼子變異

由于蛋白質功能上的需要和三聯體密碼子結構的限制，DNA蛋白質編碼區往往很少發生堿基缺失和插入[10]。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因序列未出現缺失或插入，其變異表現為堿基替換：轉換與顛換。在線粒體DNA進化過程中，通常認為發生轉換的頻率遠高于發生顛換的頻率[11]。北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共發現了116個轉換位點、32個顛換位點、3個轉換與顛換共存位點(表1)，轉換位點顯著多于顛換位點。理論上，DNA堿基發生轉換有4種可能，發生顛換有8種可能，其堿基轉換概率與顛換概率的比值應為0.5，然而由于堿基替換不是隨機發生的，以致實際上常常出現其比值大于0.5的“轉換偏差”[11]。在基因組的堿基替換變異中，DNA復制酶的嚴謹性、變異修復酶的保真性、堿基構成及理化因素影響等都會影響堿基的變異[11]。盧松柏等[12]研究了蛋白編碼基因的四倍簡并位點，在排除結構和功能上選擇壓力對突變的影響后，仍然發現四倍簡并位點存在著轉換對顛換的優勢。用誘變劑處理大腸桿菌(Escherichiacoli)發現，誘變處理會導致更高的轉換比率[13]，由此推測轉換對顛換的優勢可能還與體內含有某些誘變劑有關。Meyer[14]認為，在密碼子突變中以第3位點上的堿基變異最為常見，其中又以第3位點上的堿基轉換為最多，其次第3位點上顛換及第1位點上的轉換較多。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因密碼子第3位點堿基轉換、顛換位點分別為101個和31個，第1位點有14個轉換位點和1個顛換位點，而第2位點僅有1個轉換位點，這與Meyer[14]的結論一致。

北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因共有133個同義突變、9個非同義突變(表2)。其中，密碼子第1位點、第3位點堿基替換導致的非同義突變數占總突變數的比例分別為5/16、5/134，第2位點堿基只發生1個堿基轉換并引起了非同義突變。因此，該群體Cytb基因密碼子第1位點堿基變異導致的非同義突變數占總突變數的比例最高，而第3位點雖然發生堿基變異頻率最高，卻多為同義突變。

3.2 遺傳多樣性與入侵適應潛力

在生物群體遺傳多樣性分析中，通常用單倍型的平均遺傳距離來衡量群體中個體間的遺傳變異程度，當單倍型的平均遺傳距離大于0.01時，被認為群體變異程度大[15]。本研究中，尼羅羅非魚單倍型的平均遺傳距離為0.0781，由此，該群體產生了較大的遺傳變異。同時，群體單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數的高低，也是評價一個生物群體遺傳多樣性水平的重要指標; 由于群體中mtDNA單倍型數小于群體樣品總數，所以在評價群體遺傳多樣性時核苷酸多樣性指數較單倍型多樣性指數更為可靠[16]。Grant等[17]認為，如果群體核苷酸多樣性指數高于0.005并且單倍型多樣性指數高于0.5時，則該群體的遺傳多樣性較高。本研究中，北盤江下游尼羅羅非魚群體的核苷酸多樣性指數、單倍型多樣性指數分別為0.0671、0.8634，表明該群體具有較高的遺傳多樣性。北盤江下游尼羅羅非魚群體核苷酸多樣性及單倍型多樣性高于珠江水系斑鱖(Sinipercascherzeri)7個地理群體(核苷酸多樣性指數0.0020，單倍型多樣性指數0.7730)[15]，也高于廣西奧利亞羅非魚那馬群體(核苷酸多樣性指數0.0007，單倍型多樣性指數0.4940)及武鳴養殖群體[18](核苷酸多樣性指數0.0009，單倍型多樣性指數0.6770)。北盤江尼羅羅非魚群體單倍型多樣性與Rognon等[19]研究的非洲自然種群(單倍型多樣性指數0.8846)相似，但核苷酸多樣性較非洲尼羅羅非魚自然種群(核苷酸多樣性指數0.0311)高。因此，北盤江下游尼羅羅非魚群體Cytb基因具有豐富的遺傳多樣性。

Grant等[17]指出，群體具有較高的核苷酸多樣性、較高的單倍型多樣性，說明該群體是由一個大而穩定的種群經過了較長的歷史演化而來或者由兩個不同系群發生二次接觸所致。西江上游尼羅羅非魚野生群體源于多年來本地區引種養殖尼羅羅非魚后逃逸至河流開放水體并自行擴散。到目前為止，北盤江尚未開展尼羅羅非魚人工養殖，故該河流尼羅羅非魚群體應源于西江上游紅水河尼羅羅非魚養殖逃逸群體。由于紅水河尼羅羅非魚養殖品系差異和逃逸時間不同等原因，加大了該河流尼羅羅非魚不同群系二次接觸的可能性，因而北盤江尼羅羅非魚群體具有豐富的遺傳變異。

物種遺傳多樣性的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關; 物種遺傳多樣性越豐富，其適應能力、生存能力和進化潛力就越大，遺傳多樣性為物種的適應能力、生存能力和進化潛力提供了潛在的遺傳基礎[20]。同時，遺傳多樣性還被認為是決定外來種能否入侵成功的重要因素之一[4]。鑒于尼羅羅非魚在北盤江下游現已形成一定規模的野生種群[8-9]并具有豐富的種群遺傳多樣性，可見作為魚類外來種尼羅羅非魚在北盤江下游顯示了較強的入侵適應潛力。

研究表明，進行群體遺傳多樣性研究時，為了避免因人為取樣原因對遺傳多樣性研究結果造成影響，供試驗的樣本量應在30以上[21]。本研究中，北盤江尼羅羅非魚群體采樣的樣本量大于30，而且沿河捕撈采樣可以確保采樣過程中采集樣點涵蓋了北盤江下游全部河段。因此，本研究中，試驗分析獲得的北盤江尼羅羅非魚群體遺傳多樣性參數和結果可信度高。