流行性造血器官壞死病毒焦磷酸測序方法研究

王 娜，張 旻，張 舟，景宏麗，任 彤，張利峰，吳紹強

( 1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176； 2.北京海關技術中心，北京 101113 )

流行性造血器官壞死病是有鰭魚類一種全身性的臨床或亞臨床的感染性疾病。世界動物衛生組織將流行性造血器官壞死病列入必須報告的疫病名錄，我國將其列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類傳染病。流行性造血器官壞死病由流行性造血器官壞死病毒(Epizootichaematopoieticnecrosisvirus, EHNV)引起，流行性造血器官壞死病毒是一種雙鏈DNA病毒，屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬(Ranavirus)。紅鰭鱸(Percafluviatilis)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)是僅有的天然感染的兩種硬骨魚類。虹鱒因流行率很低，雖然死亡率高，60%～80%的瀕死魚或死亡魚中都可以分離出流行性造血器官壞死病毒，而未出現臨床癥狀的魚中，只有不到4%的魚中可以分離到病毒，所以雖然死亡率很高，但仍然不易被懷疑或被檢出[1-5]。各年齡階段的虹鱒和紅鰭鱸均易感，虹鱒的感染率低、死亡率高；而紅鰭鱸的感染率和死亡率均非常高[3-4]。我國是鱸魚和虹鱒養殖大國，如果發生流行性造血器官壞死病毒感染會給我國水產養殖業造成巨大經濟損失，因此加強流行性造血器官壞死病的監測和流行病學調查是目前比較有效的預防措施；同時進行快速精確診斷方法的研究，是當前我國流行性造血器官壞死病防控的迫切需要。目前，流行性造血器官壞死病毒檢測的標準方法主要是基于細胞培養的病毒分離，然后用組織病理、免疫熒光、ELISA、電鏡技術和PCR等手段鑒定[5]，操作繁瑣，診斷時間長，抗原捕獲ELISA可以有效鑒定該病毒，但敏感性僅為60%，且難以區分流行性造血器官壞死病毒和蛙病毒屬的其他成員[6]；PCR方法雖然靈敏，但仍會有假陽性出現的可能，需要通過測序進行確診，延長了確診時間；其他方法無法滿足在分子水平上快速確診病原的需求。

焦磷酸測序技術不需要熒光標記引物或核酸探針，不需要凝膠電泳，具有分析快速、準確、靈敏度高和實時檢測的特點，適于對已知短序列的測序分析[7-9]，廣泛應用于細菌、真菌和病毒的分型，突變位點的檢測及單核苷酸多態性分析等[10-14]。該方法在普通PCR的基礎上，對PCR產物進行測序，提高了檢測的特異性，且給出了分子診斷的黃金標準—基因序列，減少了由于PCR敏感性高而出現的假陽性結果，提高了檢測的準確性，目前該技術已經逐漸成為實驗室非常重要的DNA分析新手段[15-16]。本研究針對流行性造血器官壞死病毒ORF65基因的保守區域，利用焦磷酸測序軟件設計PCR擴增引物及焦磷酸測序引物，通過對反應條件與體系的優化，建立流行性造血器官壞死病毒ORF65基因的焦磷酸測序檢測方法，為流行性造血器官壞死病的監測和防控提供新的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株

1.2 主要試劑及儀器

DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒、PyroMark PCR Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents及焦磷酸測序儀PyroMark Q96 MD等均購自QIAGEN公司；鏈霉親和素包被磁珠購自GE公司；500 bp DNA Marker等其他試劑購自TaKaRa公司。

1.3 引物設計

根據GenBank中公布的流行性造血器官壞死病毒 ORF65基因的特異區域序列，利用PSQ Assay Design SW軟件設計PCR擴增引物EHNV-F：5′-Biotin-CTCAAGACCAAGAAGGCCATAA-3′和EHNV-R：5′-TTTTCGGACATGCTCTTCTTCA-3′及測序引物EHNV-S：5′-CTTCTCGATGCAAGAGT-3′，并在EHNV-F擴增引物5′端進行生物素標記，預期擴增片段長度為137 bp。引物合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 病毒DNA的提取

按照病毒DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取核酸，立即用于PCR擴增或置-20 ℃冰箱保存備用。

1.5 PCR反應

以病毒DNA為模板，用PyroMark PCR Kit進行PCR擴增并優化反應條件為：95 ℃預變性15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45次循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將其送往公司進行測序。剩余的PCR產物用于焦磷酸測序反應。

1.6 單鏈制備及測序反應

根據焦磷酸測序反應操作說明制備單鏈模板。將20 μL的PCR產物與30 μL ddH2O混合后與200 μg鏈霉親和素包被的磁珠混合，室溫下1400 r/min振蕩孵育15 min，用真空吸附泵吸附與磁珠結合的PCR產物，然后依次通過70%乙醇(5 s)、變性緩沖液(5 s)和沖洗緩沖液(5 s)清洗，最后移至PSQ96孔板上方釋放磁珠，96孔板中預先加入45 μL/孔含有0.3 mol/L測序引物的結合緩沖液，將96孔板放入80 ℃烘箱中加熱2 min后，冷卻至室溫。

根據儀器的軟件說明在試劑艙中分別加入底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)；然后將試劑艙和PSQ96板放入PyroMark Q96 MD測序儀中進行焦磷酸測序反應，在20～28 ℃下，所采用的堿基加入順序為15(ATGC)，每輪測序檢測運行時間為65 min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號。

1.7 敏感性試驗

將模板流行性造血器官壞死病毒DNA(5 ng/μL)依次進行10倍梯度稀釋，PCR擴增后進行焦磷酸測序反應，確定用于焦磷酸測序的最低檢測限。

1.8 特異性試驗

1.9 重復性試驗

重復進行3次試驗，比較每次測得的序列結果，確定試驗的重復性和穩定性。

1.10 樣品檢測

將實驗室保存的流行性造血器官壞死病毒感染的虹鱒肝、脾、腦等10份組織、5份未感染流行性造血器官壞死病毒的虹鱒組織及50份監測樣品，提取核酸進行焦磷酸測序檢測，并與世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的檢測方法進行比較。

2 結 果

2.1 PCR反應

以流行性造血器官壞死病毒DNA為模板，使用本研究設計的流行性造血器官壞死病毒擴增引物及優化的反應條件進行PCR檢測。結果顯示，擴增出的特異性片段符合預期大小，沒有非特異性擴增產物，滿足進行焦磷酸測序反應的需要(圖1)。公司測序結果表明，該目的條帶與流行性造血器官壞死病毒ORF65基因片段同源性為100%。

2.2 焦磷酸測序反應

流行性造血器官壞死病毒ORF65基因的焦磷酸測序結果為CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG。將該序列利用BLAST軟件進行比較，與目的基因序列符合率為100%基因，即焦磷酸測序結果與普通測序結果完全一致，該序列能夠作為流行性造血器官壞死病毒快速鑒定的靶序列(圖2)。

圖1 流行性造血器官壞死病毒 ORF65基因PCR擴增結果M.DL500 DNA Marker； 1.流行性造血器官壞死病毒 ORF65基因片段； 2.陰性對照.

圖2 流行性造血器官壞死病毒 ORF65基因焦磷酸測序結果

2.3 敏感性試驗結果

試驗結果顯示，流行性造血器官壞死病毒DNA模板10倍系列稀釋至10-4時均擴增出與目的條帶大小相符的特異性片段(圖3)；經焦磷酸測序反應，模板稀釋至10-4時，測定的序列均與流行性造血器官壞死病毒 ORF65基因的目標序列一致，為CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG。結果表明，該試驗方法最低核酸檢測限為0.5 pg/μL(稀釋度為10-4時)，以此為模板擴增得到的PCR產物可以用于焦磷酸測序。

2.4 特異性試驗結果

圖3 流行性造血器官壞死病毒敏感性試驗結果M.DL500 DNA Marker； 1～7.流行性造血器官壞死病毒 5 ng/μL、0.5 ng/μL、0.05 ng/μL、5 pg /μL、0.5 pg /μL、0.05 pg/μL、5 fg/μL; 8.陰性對照.

2.5 重復性試驗結果

重復進行3次試驗，PCR擴增結果及測得序列一致，表明該方法具有很好的重復性與穩定性。

2.6 樣品檢測

利用本研究建立的焦磷酸測序檢測方法對實驗室保存的65份樣品進行檢測。10份陽性組織樣品檢測結果為陽性(包括1份弱陽性)、5份陰性組織樣品檢測結果為陰性，50份監測樣品檢測結果均為陰性，與世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的PCR檢測結果一致，符合率為100%。

3 討 論

本試驗通過優化反應條件，成功建立了流行性造血器官壞死病毒焦磷酸測序檢測方法。該方法為國內外首次建立流行性造血器官壞死病焦磷酸檢測技術。目前該技術已經逐漸成為實驗室非常重要的DNA分析新手段[12-18]。國內研究人員針對施馬倫貝格病毒[15]、傳染性造血器官壞死病毒[16]、鯉春病毒血癥病毒[17]、貝類包納米蟲[18]等病毒和寄生蟲建立了焦磷酸測序檢測方法。國外研究人員針對新城疫病毒、流感病毒H3N2等病毒也建立了針對不同毒株變異位點的焦磷酸測序方法并通過大量的臨床樣品檢測驗證了方法的有效性，有助于進行病毒學監測和流行病學調查[14,19]。

3.1 靶序列的篩選

3.2 焦磷酸測序引物的設計

焦磷酸測序技術要求選擇的序列在100～200 bp，本研究選取編碼流行性造血器官壞死病毒ORF65基因的核酸序列，利用軟件進行序列分析后，設計了符合焦磷酸引物設計要求的擴增引物和測序引物，PCR擴增后將其產物進行焦磷酸測序反應，將獲得的特異性序列作為流行性造血器官壞死病毒鑒定的靶序列。通常情況下，焦磷酸測序反應準確測出的堿基數為20～30 bp。本研究經優化測序反應后，準確測出的堿基序列達38 bp，完全滿足證明待測樣品是否為流行性造血器官壞死病毒ORF65基因序列的確診要求，具有很好的特異性。與普通測序方法相比，檢測效率提升，檢測結果更加準確，適用于對流行性造血器官壞死病毒的大規模檢測和流行病學調查。

3.3 與PCR檢測方法的比較

根據世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》[5]中規定的PCR產物需通過測序才能最終確定病毒種類。本研究建立的流行性造血器官壞死病毒焦磷酸測序方法耗時短，一般3～4 h就可以得到基因序列，從而大大減少了病原確診時間。利用該方法對實驗室保存的65份樣品進行檢測，并與世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的常規PCR方法進行對比，結果顯示，焦磷酸測序方法與PCR方法檢測結果一致。對于其中的弱陽性樣品，常規PCR雖能檢出但由于不能滿足測序對樣本含量的要求，因而不能進行有效測序，參照世界動物衛生組織《水生動物疫病診斷手冊》的規定，由于不能進行有效測序，因而不能作為疫病陽性檢出確診的依據。而焦磷酸測序方法對于弱陽性樣品樣本可以直接給出基因序列，且檢測結果與PCR完全一致，因而說明焦磷酸方法的高靈敏度是有效的，從而避免了假陽性檢出。

本研究所建立的流行性造血器官壞死病毒焦磷酸測序檢測方法具有準確性高、重復性和穩定性好，特異性強等優點，從基因序列水平上對流行性造血器官壞死病毒進行精準檢測鑒定，為流行性造血器官壞死病毒的快速檢測和流行性造血器官壞死病的確診及流行病學調查提供了一種可行方法，對保障我國鱸魚及虹鱒等魚類養殖業的健康發展具有重要意義。