貴州分布樹蛙科泛樹蛙屬兩新記錄種
——凹頂泛樹蛙、布氏泛樹蛙

肖寧， 羅慶華， 羅濤， 魏芳， 曾亞軍

(1.貴陽護理職業學院，貴陽550081； 2. 貴州師范大學生命科學學院，貴陽550001；3.荔波縣世界自然遺產管理局，貴州荔波558400； 4. 貴州省林業科學研究院，貴陽550004)

樹蛙科Rhacophoridae泛樹蛙屬Polypedates廣泛分布于印度東部、菲律賓和婆羅洲以及東南亞等地區，目前該屬記錄有24種(Frost，2018)，中國分布有4種(Frost，2018；中國兩棲類，2018)，這4個物種各自成單系，均屬于Polypedatesleucomystax復合體(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。該屬物種的分類研究存在一定爭議(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2013)?；谇叭说南嚓P研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013)，Pan等(2013)基本理清了東南亞分布泛樹蛙屬物種的分類地位，確定了中國分布有泛樹蛙屬物種4種，即布氏泛樹蛙Polypedatesbraueri、凹頂泛樹蛙Polypedatesimpresus、斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus和無聲囊泛樹蛙Polypedatesmutus。然而，泛樹蛙屬物種在形態性狀上的保守性以及繁殖方式和棲息地環境的相似性，物種間的分類地位及分布目前仍存在較大爭議。

目前，斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙被廣泛記錄于貴州省各區縣(伍律等，1986；陳繼軍等，2007；李仕澤等，2015；黃靜等，2016；魏剛等，2017；姚正明等，2018)。在以往研究中(Yuetal.，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Lietal.，2013；Panetal.，2013)，除Li等(2013)使用了來自貴州省貴陽地區的1號樣本外(樣本編號：LJTV96)，其他研究均缺乏來自貴州地區的泛樹蛙屬物種樣品。因此，關于貴州地區泛樹蛙屬物種的組成和分布記錄有待進一步厘定。

2016—2018年在貴州茂蘭國家級自然保護區、黃平縣朱家山縣級自然保護區進行本底資源調查時采集到數只泛樹蛙屬物種標本，基于形態學比較和分子系統學分析鑒定為布氏泛樹蛙和凹頂泛樹蛙，為貴州省2新記錄。本研究對貴州分布的布氏泛樹蛙和凹頂泛樹蛙進行了形態學描述，并補充了其分子生物學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自貴州茂蘭國家級自然保護區(108°01′24.02″E，25°13′28.90″N，海拔528 m；以下簡稱貴州茂蘭)、貴州省黃平縣朱家山縣級自然保護區(107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m；以下簡稱貴州黃平)，共11號成體標本(4號斑腿泛樹蛙、3號凹頂泛樹蛙和4號布氏泛樹蛙)，對其中6雄2雌(斑腿泛樹蛙3號雄性、凹頂泛樹蛙1號雌性和布氏泛樹蛙3號雄性、1號雌性)進行了形態學性狀測量，取腿部肌肉保存于90%乙醇；10%福爾馬林浸泡標本，保存于貴州師范大學生命科學學院動物生態學標本室。

1.2 DNA提取、擴增和測序

總DNA提取自保存于90%乙醇中的標本腿部肌肉，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN Catalog No.69504)。選擇12S-16SrRNA基因片段作為分子標記，擴增引物為FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’；Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’(劉秋成等，2018)。擴增產物由成都擎科梓熙生物技術有限公司雙向測序。

1.3 系統發育分析

測序后在NCBI進行Blast比對，確定所擴增片段為12S-16SrRNA基因。在進行系統發育分析時，選擇Pan等(2013)使用的泛樹蛙屬物種12S-16SrRNA序列，以Polypedatesotilophus、P.colletti、P.maculatus、Polypedatessp.和P.macrotis為外群進行系統發育分析(表1)。

用貝葉斯法(BI)和最大似然法(ML)構建系統發育樹來確定本研究樣本的分類地位。最適模型基于赤池信息準則(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)進行模型選擇(最適模型為GTR+I+G)。BI分析在MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)進行(參數設置為nruns=4，ngen=2 000 000，samplefreq=100，nchains=4，burnin=5 000)。在Tracer 1.6(Rambautetal.，2013)中查看了相關運行參數的收斂性和有效樣本量。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中運行1 000次Bootstrap重復抽樣分析(運行模型與貝葉斯相同)。在MEGA 7.0中以物種為組采用分組的方法計算貴州樣品與Polypedatesleucomystax復合體物種間的遺傳距離(p-distances)。

1.4 形態學數據測量

依據費梁等(2009)，使用游標卡尺(Serial No.14133868，德國)測量25個形態特征(精確度0.01 mm)：體全長(SVL)、頭長(HDL)、頭寬(HDW)、吻長(SL)、眼徑(ED)、鼓膜徑(TD)、眶間距(IOS)、上眼瞼寬(UEW)、鼻間距(IND)、鼻眼距(NED)、鼻吻距(NSD)、鼓膜距離眼后角的距離(ETD)、兩眼前角距(IFE)、兩眼后角距(IAE)、前臂及手長(LAL)、前臂寬(LW)、手長(HL)、腿長(THL)、脛長(TL)、脛寬(TW)、附足長(TFL)、足長(FL)、第三指吸盤寬(FDW)和第四趾吸盤寬(DPW)。

2 結果

2.1 系統發育分析

將采自貴州茂蘭、貴州黃平的11號泛樹蛙標本的12S-16SrRNA序列上傳到GenBank，登錄號詳見表1。對泛樹蛙屬10個物種共計57號標本的12S-16SrRNA序列進行多重序列比對拼接后的堿基長度為2 368 bp?；?2S-16SrRNA序列計算的泛樹蛙屬物種間遺傳距離為1.19%～8.79%(表2)。本研究采自貴州茂蘭的泛樹蛙標本(GenBank登錄號：MK481032、MK481033、MK481034)與Pan等(2013)的凹頂泛樹蛙之間的遺傳距離為1.19%，貴州黃平和茂蘭的泛樹蛙標本(GenBank登錄號：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)與Pan等(2013)的布氏泛樹蛙之間的遺傳距離為1.49%，貴州茂蘭的泛樹蛙標本(GenBank登錄號：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)與Pan等(2013)的斑腿泛樹蛙之間的遺傳距離為2.32%(表2)。

表1 本研究中使用的樣本和序列的GenBank登錄號Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

種名Species標本號Voucher ID采集地LocalitiesGenBank登錄號GenBank accession number來源ReferencesP. leucomystaxMZB UNTemanggung, Java, IndonesiaAB728135Kuraishiet al., 2013JAM 3211Lombok Island, IndonesiaHM770313Brown et al., 2010MZB Amp 12864Banyuwangi, Java, IndonesiaAB728137Kuraishiet al., 2013KUHE 23555Brostagi, Sumatra, IndonesiaAB728128Kuraishiet al., 2013BORN 23373Keningau, Sabah, MalaysiaAB728143Kuraishiet al., 2013BORN 22430Tampaluri, Sabah, MalaysiaAB728144Kuraishiet al., 2013FMNH 244922Sabah, MalaysiaHM770266Kuraishiet al., 2013FMNH 231040Sabah, MalaysiaHM770281Brown et al., 2010外群P. otilophusKUHE 42555Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728190Kuraishiet al., 2013P. collettiMZB UNLampung, Sumatra, IndonesiaAB728189Kuraishiet al., 2013P. maculatusKUHE 42336Rajgir, Bihar, IndiaAB728188Kuraishi et al., 2013P. macrotisKUHE 42556Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728187Kuraishiet al., 2013Polypedates sp.KUHE 52552Temerloh, Pahang, MalaysiaAB728185Kuraishiet al., 2013

注：*標本保存于貴州師范大學生命科學學院動物生態實驗室， 由羅濤采集

Notes：*the specimens are kept in the Animal Ecology Laboratory， School of Life Sciences， Guizhou Normal University， all samples were collected by Luo Tao

表2 Polypedates leucomystax復合體物種間的遺傳距離Table 2 Uncorrected pairwise distances among species in the Polypedates leucomystax complex

注：#來自貴州泛樹蛙屬物種樣品

Note：#Polypedatesspecies were from Guizhou province

基于BI和ML構建的系統發育樹產生了相同的拓撲結構(圖1)，僅在末端分支節點上存在一些差異。從系統發育樹可知，來自貴州黃平的泛樹蛙樣本(GenBank登錄號：MK481029、MK481030、MK481031)和貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號：MK481039)與布氏泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=80)，來自貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)與斑腿泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=99)，來自貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號：MK481032、MK481033、MK481034)與凹頂泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=10)，與Pan等(2013)的研究有相似的樹形拓撲結構。

系統發育分析的結果表明，采自貴州茂蘭、黃平的泛樹蛙屬物種標本為布氏泛樹蛙(GenBank登錄號：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)、凹頂泛樹蛙(GenBank登錄號：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)及斑腿泛樹蛙(GenBank登錄號：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)。

圖1 基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因構建的Polypedates leucomystax復合體的系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Polypedates leucomystax complex constructed based on mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

紅色表示來自本研究的樣本

Red indicates the samples used in this study

2.2 鑒定與形態描述

2.2.1 布氏泛樹蛙的形態特征雄蛙體長約53.11 mm，雌蛙約56.57 mm(表3)；頭寬與頭長約等寬；吻前端鈍，鼻孔近吻端；眶間距約為上眼瞼距的4/3；鼓膜直徑約為眼徑的2/3；顳褶顯著；內鼻孔位置靠后，幾乎達眶前緣，左右分開較大；犁骨齒長，略向后斜列，左右相距較窄；指、趾端均具吸盤，指吸盤大于趾吸盤，但小于鼓膜直徑；第一指長小于第二指長，指關節下瘤明顯；貼體前伸達眼前端；趾蹼約為3/4；內蹠突大而突出，橢圓形，無外蹠突。

體背皮膚較為光滑，疣粒細小，但腹部及四肢腹側皮膚較為粗糙；自眼后角開始，身體兩側各有一窄細膚褶，有的個體經前臂上方一直延伸至腹股溝區，但大多數個體此膚褶較短，經肩部上方向下延伸而止于靠近前肢下方處。浸泡標本背部淺灰色或深棕灰色；眼眶間靠近上眼瞼處可見略呈三角形的淺黑色斑紋；背部散有不規則黑色小斑塊；體側皮膚有較多的黑色斑點；四肢背側橫紋清晰；股部后方有多個較大白色斑點，斑點之間的皮膚顏色為深黑色，此特征在淺灰色的浸泡標本里面更顯著；腹側皮膚黃白色(圖2，圖3)。

表3 貴州分布3種泛樹蛙物種的測量性狀量度Table 3 Morphological traits of 3 Polypedates species in Guizhou province

2.2.2 凹頂泛樹蛙的形態特征雌蛙體長約69.59 mm(表3)；身體扁而窄長；頭部扁平，頭長寬幾相等，頭頂下凹明顯，頭頂皮膚緊貼額頂骨，不能分離；吻端鈍尖，略超過下頜；吻棱顯著；鼓膜圓，緊接眼后，小于上眼瞼寬；犁骨齒列長，橫列在內鼻孔前內側，左右不相遇；背側褶無；前肢較粗壯，前臂及手長約為體長之半；指端有大的吸盤，其腹面邊緣有馬蹄形溝，第一指吸盤較??；指長順序：3>4>2>1，第四指略短于第三指；指間一般無蹼或略顯蹼跡，指側均有緣膜；關節下瘤大而明顯，指基下瘤明顯；掌突2個。后肢較細長，約為體長的1.7倍，后肢前伸貼體脛附關節達吻端或鼻孔；脛長約為體長之半，左、右跟部不重疊，足長小于脛長；趾長順序：4>5>3>2>1，第五趾略長于第三趾；趾間具蹼，缺刻深，第四趾外側蹼達第一、第二關節下瘤之間，其余各趾以緣膜達趾端；外側趾間蹼不甚發達；關節下瘤顯著，蹠部有成行小疣；內蹠突細窄，外蹠突小而不顯；指、趾端均具吸盤和邊緣溝；指、趾吸盤背面可見“Y”形跡；指細長無蹼；外側蹠間約具1/2蹼，趾間半蹼；有內蹠突，無外蹠突。

圖2 貴州省分布的3種泛樹蛙
Fig. 2 ThreePolypedatesspecies distributed in Guizhou province

A1～A7.凹頂泛樹蛙Polypedatesimpresus， B1～B2. 斑腿泛樹蛙P.megacephalus， C. 布氏泛樹蛙P.braueri

圖3 凹頂泛樹蛙、斑腿泛樹蛙和布氏泛樹蛙在保存狀態下的背側(A1、B1、C1)、 腹側(A2、B2、C2)和左側(A3、B3、C3)Fig. 3 Dorsal (A1， B1， C1)， ventral (A2， B2， C2)， and lateral (A3， B3， C3) views ofPolypedates impresus， P. megacephalus and P. braueri in preservation

皮膚較光滑，頭頂部皮膚與頭骨相連；背面滿布均勻小疣粒；顳褶平直，達肩部逐漸消失，鼓膜后方至肩部上方為黑色。胸腹部、體側及股下方密布扁平圓疣。

背部為棕色或棕褐色，具“X”形斑紋，隱或不顯，具不均勻的小黑斑，咽胸部較光滑，胸腹部和股腹面密布扁平疣。頭體及股部腹面乳白或乳黃色，僅咽喉部略褐色斑點；整個背面為淺棕色，體背面無斑紋或在肩部略顯“X”形斑；上唇緣白色，顳部有1條棕色橫紋；四肢背面均有深棕色橫紋，體側無斑；股后部無灰褐色網狀斑紋；前肢腹面和脛、跗、足部腹面為淺肉色，且具小麻斑；肛部有乳白色的扁平疣粒(圖2，圖3)。

2.3 生態環境及其習性

本研究的凹頂泛樹蛙、布氏泛樹蛙和斑腿泛樹蛙棲息環境相似，均生活在530～800 m的山間農田及其旱地生境中，周圍水域以靜水域為主，常棲息生活于稻田、草叢中，周圍喬灌木甚少。同域分布的澤陸蛙Fejervaryamultistriata、飾紋姬蛙Microhylafissipes、小弧斑姬蛙Microhylaheymonsi和黑斑側褶蛙Pelophylaxnigromaculata為優勢種。

5月可見大量個體交配，卵泡產于靜水域稻田的水稻幼苗和周圍的草叢近水處。約1周孵化完畢，蝌蚪進入靜水即可游動。

3 討論

泛樹蛙屬物種間的形態差異較小，繁殖模式和棲息地環境極為相似，中國大陸地區長期以來被認為由斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙組成(費梁等，2009，2012)。近年來，基于分子系統學的研究基本理清了東南亞地區泛樹蛙屬物種的分類地位(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。貴州省地處中國西南部，位于第二階梯之上，并處于第一階梯向第二階梯的過渡地段。較多的新物種在該地區被描述(徐寧等，2007；李松等，2008a，2008b，2010；Zhaoetal.，2008；Yangetal.，2011；王超等，2013；Wangetal.，2013；Heetal.，2015；Dengetal.，2016；Chenetal.，2017；Zhangetal.，2017；Liuetal.，2018；Lietal.，2018；李春青等，2018；Wuetal.，2018)。這表明該地區的物種多樣性較高，其物種多樣性在以往可能被低估。依據泛樹蛙屬物種背部的斑紋，即“X”形斑或者背部縱紋的數目，貴州地區該屬物種被記錄為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙(伍律等，1986；陳繼軍等，2007；李仕澤等，2015；黃靜等，2016；魏剛等，2017；姚正明等，2018)，但采用物種的體色和體背“X”形斑等特征并不能準確區分這2個物種(劉秋成等，2018)，因而，依據背部“X”形斑作為分類依據將貴州地區泛樹蛙屬物種分類為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙還有待進一步研究。本研究結果表明，貴州地區目前應該分布有泛樹蛙屬物種3種，即布氏泛樹蛙、凹頂泛樹蛙和斑腿泛樹蛙，但這3個物種的分布范圍和是否有無聲囊泛樹蛙在貴州的分布有待使用分子標記并結合形態學特征進行研究。

致謝：感謝荔波世界自然遺產管理局生物多樣性監測項目資助、黃平縣朱家山縣級自然保護區工作人員在調查過程中提供的幫助。