超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜快速分析化妝品中17種喹諾酮類藥物

廖華勇，王 景，李紅玉

(廣州華鑫檢測技術有限公司，廣東 廣州 510663)

喹諾酮類藥物(Quinolones,QNs)是一類具有4-喹諾酮結構的合成抗菌類藥物，因具有抗菌譜廣、殺菌能力強、價格低、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，被廣泛用于由細菌和支原體引起的人和動物的疾病治療[1-2]?；瘖y品作為人們日常生活的必需品，一直受到全世界人民的關注。特別是隨著生活水平的提高以及消費能力的增強，越來越多的人群開始注重皮膚保養，這就對化妝品的質量及功效提出了更高要求。然而，部分廠家為增強產品祛痘、除螨和抗粉刺的效果，在化妝品中添加喹諾酮類藥物。該類藥物可通過皮膚微血管和黏膜吸收，長期不當或過量使用可能導致其在人體蓄積，進而破壞皮膚表層菌群，導致皮疹、過敏和病原體產生抗藥性等損害。我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)[3]及歐盟化妝品法規(EC)No.1223/2009[4]均明確規定不得將抗生素類藥物作為化妝品的生產原料及添加組分。因此，建立一種靈敏、快速、準確的化妝品中喹諾酮類藥物的檢測方法對于保障化妝品質量安全具有重要意義。

目前，喹諾酮類藥物的檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)[5]、膠體金免疫層析法(GICA)[6]、電化學法(EC)[7]、毛細管電泳-電化學發光法(CE-ECL)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-11]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[12-15]、液相色譜-高分辨質譜法(LC-HRMS)[16-18]等。由于化妝品種類多、基質差異大，且違法添加的抗生素藥物含量低，這不僅要求樣品提取與凈化技術具有普適性和高效性，還要求測試方法具有良好的選擇性和高靈敏度。上述已報道的ELISA、EC、HPLC、LC-MS/MS等方法雖然可對喹諾酮類化合物進行檢測，但在選擇性和陽性確證方面仍存在不足。HRMS具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點，抗干擾能力強，可適用于基質復雜、待測物含量低的樣品分析。近年來，液相色譜-高分辨質譜聯用法越來越多地應用于化妝品等復雜基質中藥物和非法添加物質的多組分分析[16-18]。本文采用簡單的正己烷液液萃取凈化結合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q Orbitrap HRMS)，建立了一種同時測定水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品中17種喹諾酮類藥物的檢測方法。該方法操作簡單，定性定量分析準確，適用于化妝品中喹諾酮類藥物的安全性評價分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀和Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國Caliper公司)；KQ-500E數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；KDC-1044離心機(中科佳儀有限公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；MS3渦旋儀(德國IKA公司)。

標準品：氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、丹諾沙星、氟羅沙星、奧比沙星、麻保沙星、依諾沙星、洛美沙星、加替沙星、西諾沙星和那氟沙星，純度均大于98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；內標：D5-恩諾沙星(純度大于99%，德國Witega公司)；乙腈、甲醇、正己烷(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；超純水(18.2 MΩ·cm，由Millipore純水儀制備)。

樣品為隨機的市售水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品。

1.2 標準溶液配制

100 mg/L單標儲備液：分別準確稱取各標準品10 mg于100 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液(含1%甲酸)定容至刻度，-18 ℃儲存。

100 μg/L混合標準工作溶液：準確移取各單標儲備液0.25 mL于250 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液定容至刻度，使用前現配。

1.0 mg/mL內標儲備溶液：準確稱取D5-恩諾沙星10 mg于10 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液(含1%甲酸)定容至刻度，-18 ℃儲存。

1.0 mg/L內標工作溶液：準確移取內標儲備溶液0.1 mL于100 mL棕色容量瓶中，以50%乙腈溶液定容至刻度，-18 ℃儲存。

1.3 樣品前處理

稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)，置于25 mL具塞比色管中，加入1.0 mg/L內標工作溶液0.1 mL，渦旋混勻，加入20 mL 0.1%甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，以0.1%甲酸乙腈溶液定容至25 mL，搖勻。移取2.0 mL上述提取液，經10 000 r/min高速離心2 min后，準確移取1.0 mL上清液于50 ℃水浴中氮吹至近干，用10%乙腈溶液定容至2.0 mL，加入2 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋振蕩1 min后，4 000 r/min離心2 min，下層清液經聚四氟乙烯濾膜過濾后待測定。

1.4 檢測條件

液相色譜條件：Agilent Poroshell EC C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)色譜柱；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水，梯度洗脫條件：0.0～8.0 min，10%～30%A；8.0～8.1 min，30%～10%A；8.1～12.0 min，10%A；流速：0.3 mL/min；進樣量：5.0 μL。

質譜條件：加熱電噴霧離子源(HESI)溫度為350 ℃；毛細管電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣壓力為 0.276 MPa，輔助氣流速為 3.3 L/min；全掃描/二級離子掃描(Full Scan/dd-MS2)模式:采集范圍為m/z100～600，正離子采集；一級質譜分辨率為70 000 FWHM，二級質譜分辨率為17 500 FWHM；歸一化碰撞能量(NCE)為17.5、35.0、52.5 eV。其他分析參數見表1。

表1 17種喹諾酮類藥物的分析參數Table 1 Analysis parameters of 17 quinolones

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇考察了Agilent Poroshell EC C18(4.6 mm×150 mm，2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)和Thermo Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)3種液相色譜柱對17種喹諾酮類化合物的分離效果。結果顯示：后2種色譜柱對目標化合物的保留相對較差，色譜峰的半峰寬較寬，丹諾沙星、司帕沙星等部分化合物的峰形出現拖尾；而所有目標化合物在Agilent Poroshell EC C18色譜柱上均能實現有效保留，且重現性好，因此選擇該色譜柱對樣品進行分離。

2.1.2 流動相的選擇喹諾酮類化合物的母核結構為氧代喹啉羧酸，含有羧基和氮原子，因此在酸性條件下有利于形成[M+H]+峰。為增加化合物響應，實驗所用流動相中均加入0.1%甲酸。首先選取0.1%甲酸乙腈為有機相，考察了0.1%甲酸水、5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)為水相時的分離效果。結果表明：0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)兩種水相下化合物的出峰響應相差不大(5%以內)，但0.1%甲酸水條件下化合物的峰形對稱，因此選擇水相為0.1%甲酸水溶液，進一步比較了0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇分別為有機相時的分離效果。結果顯示，兩種有機相下目標物的質譜響應和峰形相當，但有機相為乙腈時，色譜柱柱壓低。為有效保護色譜柱，實驗最終選擇0.1%甲酸乙腈與0.1%甲酸水為流動相。在優化條件下，17種喹諾酮類化合物的響應和峰形均滿足分析要求(見圖1)。

圖1 喹諾酮類化合物的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of quinolones

2.2 樣品前處理方法的優化

2.2.1 提取方式的優化常用的化妝品樣品提取方式包括超聲萃取、渦旋振蕩和水平振蕩。由于膏霜類化妝品的黏度較大，在渦旋振蕩和水平振蕩過程中常出現分散不均勻現象。而超聲萃取法利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應來加速樣品中各組分的釋放，使其有效擴散和溶解于提取溶劑中，從而顯著改善提取效果，適合于膏霜類化妝品的前處理。實驗考察了不同超聲時間(5、10、15、20、30 min)對加標100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品中目標物提取效率的影響，結果表明，隨著超聲時間的延長，目標物的提取率逐漸增加，超聲時間為20 min時提取率達到最大，繼續延長超聲時間，提取率無顯著提高。因此，選擇超聲提取20 min。

2.2.2 提取溶劑的選擇由于喹諾酮類化合物易溶于有機溶劑，可采用乙腈進行萃取?？紤]到不同化妝品的基質特點，分別以不同體積分數的乙腈水溶液(100%、80%、50%、20%)作為提取溶劑，對加標100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品進行提取。結果顯示，提取溶劑中有機相比例≥80%時，17種化合物的提取回收率較高，可達80%以上。為便于后續氮吹濃縮，實驗選取100%乙腈為提取溶劑。此外，根據喹諾酮類化合物的pKa可知，其在酸性溶劑中溶解度更好，因此最終以0.1%甲酸乙腈為提取溶劑。

2.2.3 凈化方法的選擇喹諾酮類藥物的非法添加量一般較小，若提取液直接使用高分辨質譜測定，則化妝品中含有的大量脂類和表面活性劑等物質會對目標化合物的檢測產生嚴重干擾，因此需先對提取液進行凈化。目前，化妝品的常用凈化方法有正己烷液液萃取脫脂、分散固相萃取凈化及固相萃取柱凈化等。實驗考察了HLB固相萃取柱、PSA+C18分散固相萃取以及正己烷液液萃取脫脂3種凈化方式對加標100 μg/kg的非蠟基膏霜類化妝品的提取效果。結果表明，選取HLB固相萃取柱凈化時，目標化合物的回收率為80%～110%，但凈化步驟繁瑣，操作復雜；采用PSA+C18分散固相萃取和正己烷液液萃取脫脂凈化時，目標化合物的回收率同樣能達到80%～110%，為節約成本和便于操作，最終選擇正己烷液液萃取脫脂凈化。

2.3 方法驗證

2.3.1 線性關系、檢出限與定量下限本實驗以D5-恩諾沙星為內標，采用內標法定量，以校正ESI離子源在檢測樣品時出現的基質效應。在優化條件下，采用本方法分別測定質量濃度為0.05～20.0 μg/L的系列混合標準工作溶液，其中D5-恩諾沙星的質量濃度為4.0 μg/L。以各化合物與內標物的質量濃度比值為橫坐標(x)，以化合物與內標物的響應峰面積比值為縱坐標(y)進行線性回歸。結果表明，17種喹諾酮類化合物均在0.05～20.0 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均大于0.996 0(見表2)。

通過測定質量濃度為1.0 μg/L的混合標準溶液響應值，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算得到各化合物的儀器檢出限(ILOD)和儀器定量下限(ILOQ)。結合前處理過程中的稀釋倍數(n)和回收率(R)，計算得到17種喹諾酮類化合物的方法檢出限(LOD=ILOD×n/R)和定量下限(LOQ=ILOQ×n/R)分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。

2.3.2 回收率與相對標準偏差在優化條件下，選取2種基質(爽膚水、面霜)的陰性樣品進行加標回收實驗。每種基質分別添加2、4、20 μg/kg 3個濃度，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結果表明，3種加標水平下的回收率為82.3%～108%，RSD為3.5%～8.6%(見表2)。方法的準確度和精密度均能滿足日常檢測定量分析的要求。

表2 17種喹諾酮類化合物的相關系數(r2)、加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Correlation coefficients(r2),spiked recoveries and RSDs of 17 quinolones(n=6)

圖2 陽性樣品中氧氟沙星的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted chromatogram of ofloxacin in a positive sample

2.4 實際樣品的測定

為評價該方法的有效性，本實驗測定了隨機抽取的市售水劑、乳液和非蠟基膏霜類化妝品各10份，在1份標稱具有除痘功效的膏霜樣品中檢出氧氟沙星，檢出量為1.7 mg/kg；其他29份樣品均未檢出目標化合物。陽性樣品的提取離子色譜圖見圖2。

3 結 論

本文利用0.1%甲酸乙腈進行超聲提取，正己烷液液萃取脫脂凈化，建立了化妝品中17種喹諾酮類化合物的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測方法。通過對色譜柱、流動相等分離條件和樣品提取凈化條件的優化，得到了良好的加標回收率和精密度，方法檢出限和定量下限分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。該方法前處理簡單、適用性好，可為化妝品質量監管和控制提供技術支持。