NRF1抑制RNA病毒誘導的抗病毒天然免疫反應

齊 飛，周 斌，韓旭凌，李鵬程，武舫伊，錢 峰

(1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438； 2.復旦大學 現代人類學教育部重點實驗室，上海 200438)

病毒感染所誘導的免疫應答由宿主和病原體之間的特異性信號傳導級聯形成.宿主細胞配備有多種模式識別受體(Pattern-Recognition Receptors, PRR)，以識別病原體相關分子模式.病毒相關分子模式通常以核酸為基礎，包括雙鏈(ds)RNA，單鏈(ss)RNA和病毒DNA[1].RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ Like Receptor, RLR)是PRR中關鍵的成員[2]，包括視黃酸誘導基因Ⅰ(Retinoic acid-Inducible Gene Ⅰ, RIG-Ⅰ)和黑素瘤分化相關蛋白5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5, MDA5).RIG-Ⅰ識別ssRNA病毒，而MDA5主要負責識別微核糖核酸病毒家族成員[3-5]，通過下游信號分子激活免疫應答.

病毒感染細胞會激活細胞免疫反應產生Ⅰ型干擾素(Interferon, IFN).大多數有核細胞具有產生和響應Ⅰ型干擾素的能力[6].Ⅰ型干擾素以非常低的水平組成型表達，受病毒感染誘導至高水平[7].RIG-Ⅰ和MDA5檢測細胞質中的RNA結構，激活下游信號通路，導致干擾素調節因子3(Interferon Regulatory Factor 3, IRF3)磷酸化入核，磷酸化的轉錄因子IRF3與IFN基因特定啟動子元件結合激活轉錄.釋放到胞外的干擾素進一步與細胞膜表面受體結合啟動更多的干擾素和干擾素誘導基因的表達，發揮抗病毒效應[8-10].

核呼吸因子(Nuclear Respiratory Factor 1, NRF1)是由核基因編碼的能調控線粒體呼吸鏈表達的轉錄因子.人的NRF1基因與海膽和果蠅翅膀中的P3A2基因同源[11].基因位于染色體7q32.2，編碼出大小為68 kDa的核蛋白[12].NRF1激活線粒體呼吸鏈蛋白組份的表達，調節線粒體運輸蛋白和線粒體氧化應激相關蛋白，參與雌激素介導的線粒體生物合成和細胞代謝[13].NRF1與乳腺癌發生發展相關[14]，其動態轉錄調節與癌癥風險的預測、療效預判密切相關[15].NRF1還參與調控端粒的轉錄，影響人體健康[16].

NRF1在免疫應答領域尚未被研究.文獻報道NRF1在流感疫苗接種的免疫應答人群中活性增強[17]，暗示NRF1參與了機體的免疫反應.本研究發現了NRF1在抗病毒天然免疫領域的新功能.實驗發現NRF1參與細胞抗病毒免疫反應，調節了干擾素的產生.

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞為本實驗室保存；TRI Reagent試劑購自Sigma公司；實時定量PCR試劑購自Biomake公司；RIPA蛋白裂解液購自碧云天；NRF1和GAPDH抗體購自Proteintech公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自全式金公司；轉染試劑購自翊圣生物公司；Protein A/G agarose beads購自Santa Cruz公司.

1.2 細胞培養與熒光成像

HEK293T細胞培養于10%FBS和1%的青霉素-鏈霉素雙抗DMEM培養基，于37℃，5%CO2細胞培養箱培養.細胞感染VSV-GFP病毒(MOI=0.01)8h后，LEICA DFC310 FX熒光顯微鏡成像.

1.3 慢病毒感染建立敲低細胞系

慢病毒包裝時，取生長狀態良好的HEK293T細胞，鋪于六孔板細胞培養皿中，利用轉染試劑共轉shRNA的慢病毒載體質粒、psPAX2(病毒包裝質粒)和pMD2.G(病毒衣殼質粒)，12h后換液，48h后收集病毒上清，4000r/min離心10min，取上清感染生長狀態良好的HEK293T細胞，感染24h后傳代并用含有2μg/mL的嘌呤霉素培養基篩選.

表1 shRNA引物設計

1.4 Western blot

細胞棄去培養基，用PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4)洗干凈后，加入RIPA裂解液將細胞重懸置于冰上裂解25min，4℃離心10min后取上清，加入相應量蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，取適量進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后300mA恒流轉膜90min至PVDF膜，5%BSA封閉1h，TBST洗3次(每次5min)，加入一抗(1∶1000，5%BSA稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗3次，再加相應二抗(1∶1000，5%BSA稀釋)室溫孵育1h，加入顯色液拍照.

1.5 雙熒光素酶報告基因實驗

將細胞接種于24孔板中，待細胞密度達到80%，進行轉染實驗；每孔內加入50ng海參熒光素酶報告質粒、50ng的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒和適量的目的基因質粒，對照組用空載體配平，16h后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測.用吸引泵吸去上清，加入裂解液，置于常溫搖床裂解15min，吹打混勻裂解產物，將樣品吸至96孔酶標板中，分別依次加入試劑盒中的底物，上機檢測.

1.6 RNA抽提

細胞棄去培養基后使用PBS將培養基洗干凈，加入TRI Reagent裂解，充分震蕩打勻后，加入三氯甲烷震蕩，4℃離心取上清，加入等量異丙醇充分混勻后15000r/min離心10min，沉淀用75%乙醇洗滌，離心，棄上清，晾干，加入適量DEPC處理的水溶解，保存于-80℃冰箱.

表2 qPCR引物設計

1.7 實時熒光定量PCR

RNA通過反轉錄試劑盒去基因組和反轉錄步驟獲得cDNA.在CFX-96系統(Bio-Rad)中使用SYBR Green和基因特異性引物進行擴增，Actin基因作為內參.定量PCR引物根據表2序列合成.

1.8 免疫共沉淀實驗

實驗前將Protein A/G agarose beads用NETN(100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，0.5mmol/L EDTA，0.5%P-40)清洗5次；細胞用PBS清洗后，置于冰上加入NETN裂解液充分裂解；4℃，15000r/min離心10min，收取上清，取少量做全細胞裂解液，剩余上清用適量Protein A/G Agarose Beads，4℃孵育過夜封閉，封閉后4℃ 1000g/min離心5min；沉淀用NETN清洗5次，加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，-80℃冰箱凍存，上清加入相應抗體4℃搖床孵育2h；加入適量Protein A/G agarose Beads，孵育1h，棄上清，NETN清洗5次，加入適量的蛋白上樣緩沖液，煮沸5min，-80℃冰箱凍存.

1.9 統計分析

研究中數值用“均值±標準差”表示，實驗均重復3次以上，組間通過GraphPad Prism 6軟件的t-檢驗進行統計學分析.

2 結 果

2.1 NRF1參與細胞抗病毒反應

為了研究NRF1在病毒感染下的表達情況，通過水皰性口炎病毒(VSV)感染HEK293T細胞.結果顯示NRF1的蛋白表達水平隨病毒感染上升(圖1(a)).表明NRF1可能受病毒誘導表達，并參與到抗病毒天然免疫應答.

為了探索NRF1在細胞抗病毒反應中的潛在作用，構建NRF1敲低的HEK293T細胞系.內源性的NRF1蛋白的敲低水平通過Western blot的方法進行檢測(圖1(b))所示.利用NRF1敲低HEK293T細胞系進行病毒復制實驗，用帶有GFP熒光的VSV病毒感染8h.結果表明NRF1敲低組相比較于對照組，熒光強度明顯減弱，說明在敲低NRF1的細胞中病毒復制能力減弱(圖1(c))所示.同時利用qPCR的方法進行VSV RNA定量檢測，發現病毒的復制量在NRF1敲低的細胞中明顯少于對照組(圖1(d))所示.以上結果表明，NRF1參與細胞的抗病毒反應.

圖1 NRF1參與細胞抗病毒反應Fig.1 NRF1 is involved in cellular antiviral response(a) VSV(MOI=0.1)病毒刺激0h，2h，8h，12h，Western blot檢測NRF1蛋白水平變化；(b) Western blot檢測NRF1敲低細胞系中NRF1的蛋白表達量；(c) VSV-GFP(MOI=0.01)感染正常組和NRF1敲低組細胞，8h后熒光顯微鏡拍攝(標尺: 200μm)；(d) qPCR檢測VSV RNA水平.**P<0.01，***P<0.001.

2.2 NRF1抑制病毒誘導的細胞因子和趨化因子的產生

通過在HEK293T細胞中過表達NRF1研究其對病毒誘導的免疫應答的影響.Western blot檢測NRF1-Flag質粒的表達(圖2(a)，@@@470頁）.用VSV病毒感染過表達NRF1的HEK293T細胞，qPCR檢測誘導產生的細胞因子IFN-βRNA和趨化因子CCL5RNA的表達水平.結果顯示過表達NRF1后細胞受病毒刺激所產生的IFN-βRNA和CCL5RNA顯著下降(圖2(b)).表明NRF1抑制病毒誘導的細胞因子和趨化因子的產生.

圖2 NRF1抑制病毒誘導的細胞因子和趨化因子的產生Fig.2 NRF1 inhibits virus-induced production of cytokines and chemokines(a) Western blot實驗檢測NRF1過表達質粒表達情況；(b) 將NRF1過表達質粒轉入HEK293T細胞中16h后，用VSV病毒(MOI=0.1)刺激12h，qPCR檢測細胞因子IFN-β RNA和趨化因子CCL5 RNA的表達變化.*P<0.05.

2.3 NRF1抑制SeV誘導的干擾素信號激活

已知仙臺病毒(SeV)能被RIG-Ⅰ識別，而RIG-Ⅰ介導的RLR抗病毒信號通路是關鍵的抗病毒天然免疫信號通路.為了驗證NRF1是否對RLR信號通路有影響，通過雙熒光素酶報告基因實驗分別對RLR通路相關下游靶基因的啟動子(IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc)活性進行檢測.在HEK293T細胞中過表達NRF1，同時分別轉入IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc報告基因質粒，16h后，用SeV病毒刺激12h，裂解細胞加入試劑盒底物通過雙熒光素酶檢測儀檢測.結果發現病毒誘導的IFN-β-luc、ISRE-luc和NF-κB-luc活性都隨著NRF1表達量的增加而降低(圖3)，說明NRF1抑制SeV誘導的干擾素信號激活.

圖3 NRF1抑制SeV誘導的干擾素信號激活Fig.3 NRF1 inhibits SeV-induced interferon signaling activationNRF1抑制SeV誘導的RLR信號通路下游靶基因啟動子(a) IFN-β-luc, (b) ISRE-luc, (c) NF-κB-luc的激活.在HEK293T細胞中共轉NRF1(100～200ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示啟動子報告基因質粒(50ng)，16h后，用SeV病毒(MOI=1)刺激12h，收集樣品上機檢測，所有實驗均用空載質粒配平.

2.4 NRF1抑制RLR信號通路的激活

在RLR信號通路中，RIG-Ⅰ首先識別病毒的RNA，招募下游位于線粒體外膜的接頭蛋白MAVS，MAVS接受信號后多聚化將信號傳遞給下游激酶TBK1，TBK1和IKKε形成復合物磷酸化轉錄因子IRF3，磷酸化激活的IRF3入核結合到IFN-β特定的結構域，啟動IFN-β的表達，發揮抗病毒天然免疫功能.

為了探究NRF1在RLR信號通路中作用的靶點.在HEK293T細胞系中分別過表達RLR信號通路中關鍵分子RIG-Ⅰ、MAVS、TBK1、IKKε和IRF3，激活RLR信號通路.同時過表達NRF1檢測其對該信號通路的影響.結果如圖4所示，顯示NRF1抑制IRF3或其上游信號分子所介導的IFN-β報告基因的激活.表明IRF3是NRF1在RLR信號通路中潛在的作用靶點.

圖4 NRF1抑制RLR信號通路的激活Fig.4 NRF1 inhibits activation of the RLR signaling pathwayNRF1抑制RLR信號通路中關鍵分子(a) RIG-Ⅰ，(b) MAVS，(c) TBK1，(d) IKKε和(e) IRF3所介導的IFN-β報告基因的激活.在HEK293T細胞中共轉NRF1(100～200ng)、IFN-β-luc(50ng)、pRL-TK(50ng)和如圖所示關鍵分子質粒，16h后檢測IFN-β-luc的活性，所有實驗均用空載質粒配平.

2.5 NRF1與轉錄因子IRF3的相互作用

圖5 NRF1與轉錄因子IRF3的相互作用Fig.5 Interaction between NRF1 and transcription factor IRF3在HEK293T細胞中共轉NRF1-Flag和IRF3-HA，16h后收樣，通過免疫共沉淀實驗檢測二者的相互作用.

雙熒光素酶報告基因實驗表明NRF1潛在的作用靶點是IRF3.通過免疫共沉淀的實驗方法，將帶有Flag標簽的NRF1質粒與帶有HA標簽的IRF3質粒共轉入HEK293T細胞中，16h后收取樣品，進行免疫共沉淀實驗.結果發現NRF1與IRF3存在相互作用.該實驗結果表明NRF1可能通過與IRF3互作來抑制RLR信號通路的激活.

3 討 論

NRF1蛋白可以通過同源二聚的形式結合到特定的DNA識別序列來調控靶基因的轉錄[12].研究人員發現NRF1在膠質母細胞瘤衍生的細胞中調控691個基因轉錄，這些基因參與調節細胞生長、代謝能量產生、蛋白質翻譯和DNA復制/修復[18-19].此外，NRF1調節線粒體相關基因的轉錄，特別是調控線粒體氧化呼吸鏈中重要基因的表達.

本研究首次揭示NRF1參與抗病毒天然免疫.通過病毒感染實驗發現NRF1受病毒誘導上調.在細胞中敲低NRF1，用帶GFP熒光的VSV進行感染，結果發現敲低組細胞病毒載量變少.過表達NRF1抑制病毒誘導的細胞因子和趨化因子的產生.這些結果表明NRF1在機體免疫系統中扮演著至關重要的角色.

在RLR信號通路中，RIG-Ⅰ識別病毒的RNA后，招募接頭蛋白MAVS，接受信號的MAVS多聚化，繼續將信號傳遞給下游激酶TBK1，TBK1和IKKε形成復合物磷酸化轉錄因子IRF3，磷酸化激活的IRF3入核結合到IFN-β特定的結構域，啟動IFN-β的表達，發揮抗病毒天然免疫功能.通過過表達NRF1抑制了IRF3或其上游信號分子介導的干擾素的激活.利用免疫共沉淀的方法發現NRF1與IRF3存在相互作用.結果表明NRF1是通過RLR信號通路下游的轉錄因子IRF3來發揮其抑制功能.NRF1可能通過影響NRF1影響IRF3與IFN-β啟動子的結合抑制其轉錄活性.

天然免疫反應受到細胞內信號分子的精確調控，過強的免疫反應會誘導細胞因子風暴，對機體造成免疫病理損傷.本研究表明NRF1是作為RLR信號通路的抑制因子，它的作用可能是為了控制免疫過激.對于防止機體免疫病理損傷具有重要作用.