雙氫青蒿素對肺纖維化大鼠ERK和CTGF表達的影響

王保蘭，王立新，朱蓉

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院呼吸科，江蘇 淮安 223000)

肺纖維化是一種彌漫性肺炎性疾病，病死率高。結締組織生長因子為促纖維化生長因子參與多種增生性或纖維化疾病的發生發展，但具體致病機制尚不明確[1]。肺纖維化傳統治療以使用激素和免疫抑制劑為主，但效果并不理想。研究[2-4]證實，阻斷ERK信號通路可以抑制CTGF表達，從而干預組織纖維化。雙氫青蒿素是青蒿素的一種提取物，其對炎癥和炎癥相關性疾病具有治療作用[5]；另有實驗研究[6]證實，雙氫青蒿素還可抑制纖維化大鼠肺組織炎癥因子聚集、成纖維細胞增生及膠原蛋白沉積，提示其可能為肺纖維化的藥物治療提供新思路。袁曉梅等[7]研究發現，雙氫青蒿素可干預博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型，然其具體作用機制尚不明確。作者此前研究也發現，雙氫青蒿素可通過抑制TGFβ1和SMAD2/3的表達干預肺纖維化[8]。本實驗旨在進一步研究雙氫青蒿素對博萊霉素誘導大鼠肺纖維中ERK和CTGF表達的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與主要試劑 藥物注射用鹽酸博萊霉素購自日本化藥株式會社(批號：140372)，雙氫青蒿素購自成都歐康植化有限公司(批號：AB140901)，醋酸潑尼松片購自廣東華南藥業有限公司。TRNZOL總RNA提取試劑購自北京天根生物技術有限公司(編號：DP405-02)，TIANScriPt cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生物技術有限公司(編號：KR104-02)，SYBR Premix Ex Taq購自Takara生物有限公司(編號：RR420A)；col1(a2)引物(108bp)，上游：5′-GAGGGCAACAGCAGATTCAC-3′，下游：5′-GCGAGATGGCTTATTCGTTT-3′；ERK1引物(110bp)，上游：5′-CCCTTGACCTGAGTGATGAG-3′，下游：5′-CATAGCCCTTCCATTCCAGA′3′；ERK2引物(136bp)，上游：5′-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3′，下游：5′-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC，

內參β-actin(132bp)，上游5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，各引物由上海生工公司合成。濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司(編號：ZLI-9017)，超敏二步法免疫組化檢測試劑購自北京中杉金橋生物有限公司(編號：PV-9001)，兔抗鼠pERK1/2單克隆抗體購自CST公司，兔抗鼠ERK1/2單克隆抗體購自CST公司，兔抗鼠CTGF多克隆抗體購自博士德生物公司。

1.1.2 實驗動物與分組 SPF級SD大鼠，雄性，體重為180～220 g，由徐州醫學院動物中心提供。75只隨機分成假手術對照組、模型對照組、溶劑對照組、陽性對照組、和雙氫青蒿素治療組5組，每組15只；每組再按處死時間點分為7 d、14 d、28 d三個亞組，每個亞組5只。除假手術對照組外，所有動物氣管內注入博來霉素5 mg/kg。造模后第一天起，相應予生理鹽水、生理鹽水、5%羧甲基纖維素鈉、潑尼松5 mg/kg、雙氫青蒿素75 mg/kg，1次/d，持續至處死當天。于末次給藥8 h后處死動物，取血分離血清或血漿冷藏備用，取左肺用4%多聚甲醛固定，留取右肺冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 模型驗證 用HE染色法觀察肺組織病理形態變化，驗證肺纖維化模型是否成功。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測ERK1、ERK2、Col-1基因的表達量 (1)提取RNA：取30 mg肺組織放入液氮研缽磨成粉末，將粉末移入1.5 mL EP管，加入1 mL TRIZOL，充分搖勻，室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃，12 000 rpm離心15 min；取上層水相400 μL轉移至另一1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻。室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 rpm離心10 min；棄上清，加入預冷的75%乙醇1 mL(無核酶雙蒸水配置)，洗滌沉淀，輕輕混勻；4 ℃，7 500 rpm離心5 min；重復洗滌沉淀；棄上清液，室溫干燥5 min，50 μL無核酶雙蒸水充分溶解；取2 μLRNA原液加入98 μL無核酶雙蒸水中，充分混勻，測定RNA濃度；(2)逆轉錄：在冰浴無核酶離心管中加入2 μL RNA原液(5 μgRNA)、2 μL Oligo(dT)、2 μL Super Pure dvip，補無核酶雙蒸水定容至14.5 μL；70 ℃加熱5 min后迅速在冰上冷卻2 min，簡短離心后加入4 μL 5xFirst-strumd buffer(含DTT)、0.5 μL Rvasin、1 μL IIAScript m-MLV，輕輕用移液器混勻；42 ℃溫浴50 min；95 ℃加熱5 min終止反應，冷凍保存于-20 ℃冰箱。(3)熒光定量PCR：按照Takara SYBR Premix試劑盒說明書配制擴增反應體系，上機，94 ℃ 3 min，(94 ℃30 s 56 ℃30 s 72 ℃30 s 72 ℃ 10 min)共36cycle，測定CP值，用雙delta法計算，結果用2^(-△△Ct)表示。

1.2.3 免疫組化法檢測CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白的表達量 石蠟切片常規脫蠟、沖洗，用檸檬酸緩沖液行高壓抗原修復，3% H2O2去離子水(終50 μL)37 ℃孵育15 min，以滅活內源性過氧化物酶活性；滴加試劑A室溫孵育10 min，頃去，滴加CTGF(1∶100)、ERK1/2(1∶400)、pERK1/2(1∶400)稀釋一抗，4 ℃冰箱過夜，滴加試劑B37 ℃孵育10 min，滴加試劑C 37 ℃孵育10 min，顯微鏡下控制DAB顯色時間，自來水沖洗，終止顯色，蘇木素復染5 min，水洗1 min，鹽酸分化3 s，水洗1 min，碳酸鋰返藍1 min，水洗1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，光鏡下拍攝下免疫組化染色圖片，每張切片隨機選擇五個視野各采集一張，用Image-Pro Plus6.0進行圖像分析，選定染色陽性區域，記錄IOD和Area，計算IOD/Area，并取五張的平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 病理形態改變

顯微鏡下觀察假手術對照組大鼠肺組織結構清晰，各時間點肺泡結構正常，無明顯病理改變；模型對照組大鼠7 d時肺組織呈急性炎癥反應，肺泡間質有大量炎癥細胞浸潤，伴有水腫出血，14 d時肺泡壁增厚，肺泡結構破壞，成纖維細胞增生，可見較多膠原沉積，28 d時肺泡結構大量破壞，肺泡壁顯著增厚，肺纖維化瘢痕形成，膠原纖維大量沉積；與模型對照組相比，陽性對照組前期肺泡炎癥輕，后期肺泡間隔增寬、肺泡結構破壞及膠原沉積程度輕；與陽性對照組比較，雙氫青蒿素治療組前期肺泡炎癥程度與之相似，后期肺泡結構完整性較好，膠原沉積量少。見圖1。

2.2 熒光定量PCR法檢測各組肺組織中Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量

模型對照組大鼠肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量均比假手術對照組高(P<0.01)，模型對照組與溶劑對照組組間各基因相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，雙氫青蒿素治療組Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量均低(P<0.01)；與陽性對照組比較，7 d、14 d雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)，28 d雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織 Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量低(P<0.01)，實驗結果見表1。

2.3 免疫組化法測大鼠肺組織CTGF、ERK1/2、pERK1/2表達量

與假手術對照組比較，模型對照組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達量高(P<0.01)，模型對照組與溶劑對照組組間CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達量少(P<0.01)； 7 d、14 d雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達量與陽性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；28 d時雙氫青蒿素治療組CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達少于陽性對照組(P<0.05)。見圖2-圖4及表2。

表1各組不同時間點肺組織Col1(a2)、ERK1、ERK2基因相對表達量測定結果(2^(-△△Ct)值，n=5)

組別Col1(a2)ERK1ERK2假手術對照組 7 d0.96±0.0530.97±0.0330.96±0.141 14 d1.01±0.0551.01±0.0450.99±0.238 28 d1.09±0.0641.08±0.0391.03±0.056模型對照組 7 d2.41±0.128*2.27±0.201*1.79±0.791* 14 d4.60±0.131*3.52±0.391*2.57±0.606* 28 d4.60±0.131*5.33±1.003*6.70±1.003*溶劑對照組 7 d2.23±0.0922.15±0.2871.65±0.584 14 d4.29±0.2793.40±0.9092.44±0.811 28 d8.37±0.9344.69±0.9127.09±1.214陽性對照組 7 d1.30±0.0411.02±0.0511.34±0.062 14 d2.94±0.1232.32±0.0831.63±0.413 28 d3.87±0.2223.69±0.1744.01±0.513雙氫青蒿素治療組 7 d1.34±0.032#1.10±0.037#1.28±0.038# 14 d2.47±0.081#1.45±0.061#1.53±0.307# 28 d3.18±0.131#△2.07±0.091#△2.67±0.285#△

*P<0.01，與假手術組和雙氫青蒿素治療組相比；#P<0.01與模型對照組相比；△P<0.01，與陽性對照組相比。

表2各組不同時間點肺組織CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達測定結果(IOD/Area，n=5)

組別CTGFERK1/2PERK1/2假手術對照組 7 d0.11±0.0710.08±0.0830.06±0.067 14 d0.12±0.1030.10±0.0780.09±0.071 28 d0.09±0.0800.11±0.0520.10±0.043模型對照組 7 d0.27±0.132*0.23±0.105*0.21±0.121* 14 d0.31±0.201*0.29±0.153*0.28±0.146* 28 d0.23±0.164*0.31±0.141*0.30±0.134*溶劑對照組 7 d0.26±0.1840.24±0.1100.21±0.109 14 d0.32±0.2320.27±0.1710.24±0.143 28 d0.22±0.1750.30±0.1520.29±0.118陽性對照組 7 d0.18±0.1100.16±0.0860.14±0.105 14 d0.21±0.0930.17±0.0990.15±0.094 28 d0.16±0.0740.22±0.1010.18±0.075雙氫青蒿素治療組 7 d0.17±0.097#0.14±0.079#0.13±0.082# 14 d0.19±0.102#0.15±0.085#0.15±0.077# 28 d0.13±0.081#△0.16±0.063#△0.13±0.083#△

*P<0.01，與假手術組和雙氫青蒿素治療組相比；#P<0.01與模型對照組相比；△P<0.05，與陽性對照組相比。

3 討論

肺纖維化是進展性、致死率極高的疾病，隨著對肺纖維化發病機制的深入研究，國內外的研究熱點集中于尋找新的抗纖維化藥物，并盡可能在疾病的早期進行干預治療[9]。研究[10]發現，肺纖維化是多種細胞因子、生長因子調節失衡的結果，成纖維細胞增殖分化，細胞外基質大量沉積為其特征性表現。雙氫青蒿素類藥物除了抗瘧作用外，還具有抗炎、抗纖維化的[11]藥理作用。

ERK蛋白是MAPK家族的一員，所介導的信號傳遞途徑是涉及調節細胞生長、發育及分裂的信號網絡的核心，在多種細胞異常增殖類疾病(如腫瘤，纖維化疾病等)中起到了重要的作用[12-13]。研究[14-15]證實，ERK信號通路與肺纖維化發生關系密切，可介導靶細胞的分化、增殖、合成、分泌細胞外基質以及誘導細胞凋亡及其炎性反應等多種細胞生物學效應。ERK通路是調節CTGF表達的重要信號通路，實驗證實阻斷ERK通路可抑制血管緊張素II誘導細胞的CTGF表達[16]。另有研究[17-19]證實，肺成纖維細胞過表達CTGF與肺纖維化關系密切,抑制CTGF的表達對肺纖維化進展有干預作用。本研究對雙氫青蒿素對肺纖維化模型大鼠肺組織中CTGF、ERK1/2基因和蛋白表達的影響進行探討。

由本研究病理學結果可知，模型組大鼠肺泡結構完整性破壞嚴重，肺泡間隔厚，肺組織中有大量疤痕組織形成，假手術對照組大鼠肺泡結構未見明顯異常，證實博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型構建成功。與模型對照組比較，雙青蒿素治療組大鼠肺組織可見少許纖維疤痕組織，然肺泡結構的完整性較好，肺泡間隔較薄，說明雙氫青蒿素可改善模型大鼠的肺纖維化破壞程度。從熒光定量PCR結果可知雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織Col1(a2)基因表達量少于模型對照組大鼠。細胞間質膠原纖維大量沉積是肺纖維化的顯著特征，Col1(a2)為膠原纖維的主要組成成分之一，雙氫青蒿素抑制Col1(a2)基因的表達，可減輕肺纖維化程度，袁曉梅等人關于雙氫青蒿素干預肺纖維化的研究結果支持作者研究結果。從熒光定量PCR及免疫組化結果可知雙氫青蒿素治療組大鼠肺組織ERK1、ERK2的基因表達及CTGF、ERK1/2、pERK1/2蛋白表達量均少于模型對照組大鼠，說明雙氫青蒿素對CTGF、ERK基因及蛋白的表達具有一定的抑制作用。CTGF可介導肺成纖維細胞增生、遷移和分化，CTGF是肺組織損傷和纖維化的必須生長因子[15]。ERK信號通路是除SAMD2/3信號通路外調節CTGF表達的重要信號通路，作者將CTGF基因及蛋白表達與ERK基因及蛋白表達的相關性進行比較，得出兩者各時間點均呈正相關。有研究[20]證實，ERK1/2磷酸化可干預人成纖維細胞CTGF的表達，這也支持本研究結論。

綜上，ERK和CTGF的表達與肺纖維化關系密切，雙氫青蒿素對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中ERK和CTGF基因和蛋白的表達有干預作用，這為肺纖維化的新藥研究及肺纖維化的靶向治療提供新思路。