土著細菌胞外聚合物對淺層地下水系統中砷增強的生物指示

魏小凡，謝作明，王 晶，高 班，孫家正，羅 艷

(1.中國地質大學(武漢)環境學院，湖北 武漢 430074；2.湖北省監利環境保護局環境監測站，湖北 監利 433300)

高砷(As)地下水已在多個國家和地區被發現[1]。砷的代謝微生物廣泛參與砷的生物地球化學循環[2]，在高砷地下水的形成中扮演著重要角色[3]。砷對微生物具有較強的毒性，砷酸鹽由于和磷酸鹽具有相似結構，使細菌表現出“磷酸鹽饑餓”癥狀，而對微生物產生毒性[4]。As(III)比As(V)毒性更強，可直接使蛋白酶失活[5]。由于長期暴露在高砷環境中，微生物進化出了耐砷基因，從而可以忍受高砷脅迫而適應高砷環境[6]。Oremland等[3]揭示了基于細菌還原砷酸鹽或氧化亞砷酸鹽的DNA系統的進化多樣性，隨著研究的深入，更多的砷代謝機制被發現[7]。

細菌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)附著在細菌表面或圍繞在細菌周圍，主要包含多糖和蛋白質，還有少量核酸、腐殖質和糖醛酸等物質。細菌EPS是決定微生物表面性質的關鍵物質[8]，在環境脅迫下，微生物會分泌更多的EPS[9]，而EPS圍繞在細胞表面形成屏障，避免金屬離子進入微生物胞內，以降低重金屬的毒害作用[10]。細菌EPS中含有很多帶負電荷的基團如羥基、氨基、羧基和酰胺基等[11]，可以通過表面絡合、靜電吸附[8]和離子交換[12]等吸附環境中的Cu、Zn、Pb、As等金屬或類金屬。林青華等[13]研究認為As(III)可以與細菌EPS中蛋白質Ⅱ的多類位點結合，并且這個反應是一個自發的放熱過程，同時細菌EPS可能也參與了砷的還原過程；Babechuk等[14]利用Shewanellasp.ANA-3研究時發現細菌EPS上聚集有砷的還原產物。其他變價金屬Ag、U、Cr在細菌EPS的作用下也會發生氧化還原反應，如Marshall等[15]研究發現，在厭氧條件下ShewanellaoneidensisMR-1分泌的細菌EPS具有結合和還原U的能力；Vigneshwaran等[16]研究發現，細菌EPS中的蛋白質能將Ag+還原成Ag納米顆粒；此外，Batool等[17]研究也發現，在Cr(VI)的刺激下，微生物產生的細菌EPS包含一些Cr(VI)的還原酶，能將Cr(VI)還原為Cr(III)。

基于上述研究，本文以大同盆地高砷含水層沉積物中土著細菌D51001-1為生物材料，通過對該土著細菌進行不同形態砷脅迫培養，分析了厭氧條件下土著細菌D51001-1受As(V)和As(III)脅迫時的生長特征，以及細菌培養液中生物量、砷形態和細菌EPS組分的變化，并研究砷脅迫下土著細菌的防御機制和土著細菌對砷增強的響應機制，為地下水中砷的生物修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

試驗所用土著細菌菌株為D51001-1(以下簡稱細菌)，由中國地質大學(武漢)環境學院謝作明課題組從大同盆地高砷含水層沉積物中篩選得到。

據研究，山西大同盆地高砷地下水區屬于富有機質還原水化學環境，pH值偏弱堿性，其變化范圍為7.5～8.6；無機砷以As(III)和As(V)兩種形態存在，并且主要以砷酸鹽為主，砷含量的變化范圍為0.6～1 820 μg/ L，部分地區超過2 000 μg/ L[18]。

1.2 培養基的配制

LB培養基對細菌進行擴大培養，其配方為：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

無機鹽培養基模擬大同盆地高砷地下水環境，具體成分如下：KH2PO40.14 g/L，KCl 0.50 g/L，CaCl20.13 g/L，NaCl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.62 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，60%乳酸鈉5.4 mL/L，酵母提取物 1.00 g/L。少量酵母提取物提供微量元素，調節pH值至8.0左右，121℃高溫蒸汽滅菌30 min。

1.3 砷脅迫下土著細菌D51001-1的生長

將土著細菌D51001-1在LB培養基中培養至對數期，為消除有機培養基中有機質對細菌ESP的影響，用0.9%NaCl溶液洗滌細菌使其重新懸浮于去離子水中制成細菌重懸液(OD600值為0.939)。

在兩組250 mL無菌的無機鹽培養基中分別添加As(V)和As(III)，最終濃度均為2 000 μg/L，設為試驗組，另設一組不添加As作為對照組，其他條件與試驗組保持一致，每組試驗分別設3個平行。在厭氧操作箱中接種細菌重懸液，接種量均為2%；搖勻加蓋后用密封帶密封，置于30 ℃恒溫培養箱中連續培養；在厭氧培養箱中每隔24 h取樣一次，并用紫外分光光度計于600 nm處測定OD600值，并繪制細菌生長曲線。

砷含量的測定采用原子熒光光度法(AFS-930，北京吉天儀器有限公司)[19]。菌液先經0.22 μm濾膜過濾得上清液，上清液過離子交換柱分離得到As(III)和As(V)，因儀器檢測范圍限制，需對分離后的砷溶液進行稀釋，保證其濃度低于50 μg/L；然后取1 mL含As(V)溶液，加入1 mL 50%鹽酸和2 mL硫抗(硫脲+抗壞血酸)預還原并定容至10 mL，并與等體積的As(III)溶液樣品一起上機檢測，儀器自動測定砷溶液標準曲線，其R值達到0.999以上；最后根據砷溶液標準曲線計算稀釋后的砷濃度，其結果乘以稀釋倍數即得上清液中As(V)和As(III)的濃度。

1.4 土著細菌D51001-1分泌EPS的提取和測定

試驗采用改進的EDTA法[20]提取細菌培養液中EPS。首先向菌懸液添加等體積2%的EDTA溶液，在25℃和300 r/min條件下搖床振蕩提取3 h，再以12 000 r/min轉速離心15 min，上清液用0.22 μm 醋酸纖維素濾膜過濾，濾液即為細菌EPS粗提液；然后將細菌EPS粗提液用3 000 Da透析袋透析去除雜質，室溫下用去離子水透析48 h，得到提純細菌EPS；最后將提純的細菌EPS定容，測定其中蛋白質、多糖和核酸的質量分數。蛋白質質量分數采用Bradford法測定，以牛血清蛋白為標準物質[21]；多糖采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖為標準物質[22]；核酸采用二苯胺比色法測定，以小牛胸腺DNA為標準物質[23]。

1.5 土著細菌D51001-1細胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

分別取上述處理組和對照組細菌對數生長期的菌懸液，以5 000 r/min轉速離心10 min，收集細菌細胞，真空冷凍干燥，得細菌細胞樣品，采用KBr壓片法對細菌細胞樣品利用傅里葉轉換紅外光譜分析儀(Nicolet iS50，美國賽默飛世爾科技有限公司)進行掃描分析，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1。

1.6 數據處理

本次試驗所得數據主要用Excel和Origin 8.0軟件進行分析與處理。

2 結果與討論

2.1 砷脅迫下土著細菌D51001-1的生長

光密度(OD)通常用作指示細菌的生長[24]，圖1為不同砷形態下土著細菌D51001-1的生長曲線。

圖1 不同砷形態下土著細菌D51001-1的生長曲線

由圖1可見，細菌D51001-1在As(V)和As(III)的脅迫下均可以生長，但是存在生長差異；不同處理組下細菌均在第1 d達到最大生物量，隨后逐漸下降；細菌培養1 d后，As(V)處理組和對照組的OD600值分別為0.156和0.154，幾乎相同，而As(III)處理組的OD600值只有0.124，相比對照組降低了21%，說明細菌對As(V)脅迫具有較強的適應能力，As(V)對生物體的毒性也低于As(III)[3]，因此前期細菌生長幾乎不受影響；而As(III)由于抑制了細菌的生物合成途徑[25]，能夠顯著抑制細菌的生長，所以溶液中細菌的生物量低；隨著培養時間的延長，As(V)處理組的細菌生物量下降速率大于對照組，5 d后的OD600值比對照組降低了17%，可能是因為As(V)的毒性影響了細菌的生長與繁殖。

2.2 土著細菌D51001-1對砷形態轉化的影響

圖2為土著細菌D51001-1培養液中砷含量的變化。

圖2 土著細菌D51001-1培養液中砷含量的變化

由圖2可見，As(V)處理組溶液中As(V)含量由2 000 μg/L減少到794 μg/L，同時溶液中As(III)含量增加到1 058 μg/L，大量As(III)的產生表明土著細菌D51001-1具有還原As(V)的能力，這是由于耐砷菌株中的砷抗性系統，如磷酸鹽特異性轉運系統[26]和ars操縱子[27]可以將細菌細胞中的砷排出胞外，從而減少砷富集對細菌細胞的傷害[28]；每個As(V)和As(III)處理組溶液中所測得的總砷含量均低于初始總砷含量，表明有較小一部分砷被細菌吸附；在第1 d內，As(V)處理組溶液中As(V)含量快速下降，而As(III)含量急劇增加，表明細菌對As(V)的還原效率最高，可能是因為第1 d內細菌的活性最強，因而表現出最高的砷還原能力；隨著溶液中As(III)含量增加，砷的毒性增強，加之溶液中營養物質減少，細菌的活性減弱，細菌對As(V)的還原速度減緩；而As(III) 處理組幾乎未檢測出As(V)，說明該細菌對As(III)沒有氧化還原能力。

2.3 砷脅迫對土著細菌D51001-1分泌EPS的影響

細菌分泌的EPS含量采用蛋白、多糖和核酸含量的加和，圖3為As(V)和As(III)脅迫下土著細菌D51001-1的EPS分泌量。

圖3 As(V)和As(III)脅迫下土著細菌D51001-1的EPS分泌量

由圖3可見，各處理組和對照組的細菌EPS均在1 d內快速積累，和細菌生長保持一致；對照組中細菌EPS增加是細菌正常積累導致，到了后期細菌生物量有所下降，溶液中細菌EPS的積累速度變慢；不同處理組細菌分泌的EPS積累量差異顯著，表現為As(III)處理組>As(V)處理組>對照組。這是由于細菌對砷脅迫的應激反應表現為細菌的EPS分泌量增加，以減少有毒物質對細胞的不良影響[9]，而細菌增加EPS分泌量的方式可能是其應對砷脅迫的自我保護機制，所以在毒性更強的As(III)脅迫下，細菌增加EPS的分泌量。Saltikov等[29]也認為細菌可以通過分泌EPS降低亞砷酸鹽對細菌群落的毒害作用?？梢?，土著細菌D51001-1可以還原As(V)到毒性更強的As(III)，是導致As(V)處理組中細菌EPS含量增加的另一個原因。

圖4為砷脅迫對土著細菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影響。

圖4 砷脅迫對土著細菌D51001-1分泌EPS(蛋白、多糖、核酸和多糖/蛋白)的影響

由圖4(a)可見，培養期內各試驗組中細菌胞外蛋白的分泌量依次為As(III)處理組>As(V)處理組>對照組，表明細菌胞外蛋白的分泌隨砷毒性的增強而增多。這是由于蛋白中含有疏水性基團[30]，蛋白含量的增加一方面可以增強細胞間的親和力，促進細菌團聚體的形成，從而避免溶液中砷對單個細胞的毒害；另一方面細菌細胞中的部分蛋白(如金屬硫蛋白類蛋白)對As、Cd、Hg等重金屬或類金屬有一定的抗性[31-32]，因此蛋白的增加可以增強細菌的抗砷能力。由圖4(b)可見，各試驗組中細菌胞外多糖的分泌趨勢與胞外蛋白相同，即隨著砷毒性的增強，細菌分泌的胞外多糖含量逐漸增多。這是由于細菌可通過增加胞外多糖的分泌量加厚細胞外的胞外多糖層，抵御砷離子的脅迫，從而抵抗As(III)的侵害[33]。除蛋白和多糖的分泌以外，胞外環境中核酸含量的多少也可以指示細菌細胞的受損程度，核酸含量越高表明細菌細胞受損越嚴重。由圖4(c)可見，As(V)處理組中細菌的核酸含量比As(III)處理組低，說明As(III)導致細菌細胞受損更嚴重，不添加砷的溶液中檢測出的核酸含量增加是由于細胞的自然死亡導致的。圖4(d)反映了溶液中多糖與蛋白的含量比值(即多糖/蛋白)，對照組中蛋白與多糖含量相差較小，而處理組中蛋白含量明顯超過多糖含量，且As(III)處理組中細菌胞外多糖與蛋白含量的比值小于As(V)處理組。這是由于多糖與蛋白含量的比值反映了細菌表面正負電荷中和的結果[34]，隨著砷脅迫的增強，細菌分泌的蛋白含量遠遠超過多糖含量，導致細菌表面正電荷增強，從而減少對砷的吸附。

2.4 土著細菌D51001-1細胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

圖5為砷脅迫下土著細菌D51001-1細胞的傅里葉紅外光譜(FTIR)譜圖。

圖5 砷脅迫下土著細菌D51001-1細胞的傅立葉紅外光譜(FTIR)譜圖

由圖5可以看出：

(2) 與對照組相比，經過砷處理的細菌細胞譜圖中部分吸收峰發生了偏移，表明經過砷脅迫后細胞表面的部分官能團發生了相應變化。其中，在3 433 cm-1位置的吸收峰偏移到3 431 cm-1和3 432 cm-1處，這說明As(V)和As(III)與—OH結合在一起；在1 637 cm-1位置的吸收峰偏移到了1 639 cm-1和1 638 cm-1處，表明酰胺基與As(V)和As(III)結合后發生的伸縮振動變化；在900 cm-1位置的吸收峰偏移到了876 cm-1處，說明細菌表面物質中的苯環被取代，可能是緊密結合在細菌表面的EPS吸附了As(III)所致。土著細菌D51001-1細胞FTIR譜圖中的吸收峰偏移和峰值強度變化證實了該細菌表面具有的官能團對砷具有一定的吸附作用。

3 結 論

淺層高砷地下水環境中，土著細菌D51001-1通過在生理生化特性方面作出相應調整以便適應在砷脅迫環境中生存。本文通過室內微宇宙模擬研究表明：淺層地下水系統中土著細菌D51001-1將As(V)還原為As(III)，增強了砷的毒性，為了應對砷毒性增強而導致的環境脅迫加劇，土著細菌通過增加EPS的分泌，并提高細菌EPS中蛋白和多糖的比例，同時利用細菌表面具有的多種官能團如羥基、羧基、酰胺基等增強對砷的結合能力，從而降低地下水環境中砷對細菌細胞的傷害。因此，可以利用土著細菌這些特征性的變化來指示淺層地下水系統中的砷異常。