寧夏枸杞根和莖的化學成分及抗炎活性研究

蘭 婷，黃遠鵬，梁秋萍，周光雄

暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所 廣東省普通高校中藥和天然藥物藥效物質基礎重點實驗室，廣州 510632

全球共有枸杞屬植物80多種，離散分布在北美洲、南美洲、澳洲、歐亞大陸、太平洋島嶼和南非等地區。在我國，枸杞屬植物有7個種3個變種，主要分布于我國北部和西北部地區[1]。枸杞屬植物在我國作為傳統中藥材的藥用歷史悠久，主要涉及的種為枸杞(LyciumchinenseMill.)和寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)?！侗静菥V目》記：“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名生長草；秋采籽，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”[2]。中藥枸杞子為寧夏枸杞的干燥成熟果實，其性味甘平，歸肝、腎經，另一常用中藥地骨皮是枸杞或寧夏枸杞的干燥根皮，具有涼血、除熱、清肺降火的功效[3]。從寧夏枸杞中分離純化的天然活性成分主要包括生物堿類、黃酮類、苯丙素類、類胡蘿卜素、多糖類等[4,5]?，F代藥理研究表明，寧夏枸杞具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、肝保護、神經保護、視力保護等作用[6,7]。

為拓寬枸杞類植物中的生物活性成分類型，進一步加深對寧夏枸杞藥效物質基礎的認識，豐富寧夏枸杞開發利用的理論基礎，本實驗采用多種色譜分離技術和波譜手段，系統分離了寧夏枸杞根和莖部，確定了12個化合物(圖1)，其均為首次從該植物中分離得到。對分離得到的化合物進行細胞活力和體外抗炎活性測試，發現化合物2能顯著地抑制NO釋放活性，為后續尋找寧夏枸杞中具有抗炎活性的天然活性成分提供了一些科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

液相用水(廣東怡寶公司生產純凈水20180407)；BP211D 電子天平(Sartorouius公司)；硅膠(青島海洋化工廠0180011)；KQ5200E 型超聲波清洗器儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TLC 預制板(青島海洋化工廠20170919)；Eyela 旋轉蒸發儀；ODS(Silicycle 公司76231)；色譜級甲醇(山東禹王公司20180426016)；液相分析色譜柱為Ultimate XB-C18(5 μm,4.6× 250 mm)(美國Welch 公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia 公司10179062)；液相半制備色譜柱為Ultimate XB-C18(5 μm,10× 250 mm) (美國Welch 公司)；核磁用氘代試劑(Merck公司PR-286431012517MEI)；Bruker AV-300、AV-400和AV-600 型核磁共振儀(德國布魯克公司)；LC-100 型液相色譜儀(上海伍豐科學儀器有限公司)；Agilent 6120 LC/MS TOF 質譜儀(美國安捷倫科技公司)；Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；Waters Synapt G2 TOF 高分辨質譜儀(英國沃特世公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT,Sigma MKCC5045)；Thermo Scientific酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；胎牛血清(杭州四季青公司18120502)；DMEM培養基(美國Gibco公司2047946)；青-鏈霉素(美國Hyclone公司1881460)，其他試劑均為分析純。

1.2 藥材來源

本實驗所用寧夏枸杞干燥根、莖采集時間為2015年10月，采集地為甘肅省酒泉市瓜州縣，鑒定人為中國科學院昆明植物研究所劉恩德博士，經鑒定該藥材為茄科植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥根和莖。

圖1 化合物1～12的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-12

1.3 細胞株

從暨南大學藥學院凍存細胞庫中復蘇得本實驗所用的巨噬細胞RAW 264.7。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

將10 kg寧夏枸杞干燥根和莖晾干，粉碎后加乙醇(10倍量，95%)進行兩次熱回流提取，再用乙醇(80%)進行一次熱回流提取，均為2 h/次，過濾，合并三次提取液，經濃縮后得640 g總浸膏。向總浸膏中加入水懸浮(適量)，先后用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到萃取液后分別濃縮，最終獲得石油醚部位萃取物(107.3 g)、乙酸乙酯部位萃取物(145 g)。石油醚部位(107.3 g)經硅膠柱洗脫(石油醚/乙酸乙酯100∶0→0∶100)再經TLC分析后合并，得Fr.1-20共20個餾分。其中Fr.4經硅膠柱多梯度洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)后，得到化合物12(415.8 mg)。乙酸乙酯部位(145 g)先后經硅膠柱洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)以及TLC分析合并，得到18個餾分Fr.1-18。其中Fr.3經硅膠柱洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)，再通過TLC 分析合并得到10個子餾分Fr.3-1～ Fr.3-10。Fr.3-3經半制備液相色譜(甲醇/水60∶40)制備得到化合物9(13.8 mg)。Fr.3-7經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜等度洗脫(二氯甲烷-甲醇50∶50)，得到化合物6(16.3 mg)，Fr.3-10經過Sephadex LH-20凝膠柱色譜等度洗脫(二氯甲烷-甲醇50∶50)，得到4個子餾分Fr.3-10-1 ～ Fr.3-10-4，其中Fr.3-10-4經半制備液相色譜(甲醇/水55∶45)制備得到化合物7(2.5 mg)。Fr.6經硅膠柱色譜梯度洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)，再通過TLC合并得到7個子餾分Fr.6-1 ～ Fr.6-7。Fr.6-2經過Sephadex LH-20凝膠色譜柱等度洗脫(二氯甲烷-甲醇50∶50)，得到化合物8(2.8 mg)。同時，Fr.6-2-3經半制備液相色譜(甲醇/水58∶42)制備得到化合物11(9.7 mg)。Fr.8經過ODS開放柱多梯度洗脫(甲醇-水1∶5→100∶0)，得到8個子餾分Fr.8-1～Fr.8-8。Fr.8-5經硅膠柱洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)得到化合物3(2.4 mg)。Fr.8-6經過Sephadex LH-20凝膠色譜柱以純甲醇系統洗脫，得到Fr.8-6-4再經半制備液相色譜(甲醇/水65∶45)制備得到化合物10(5 mg)，Fr.8-6-7經半制備液相色譜(甲醇/水60∶40)制備得到化合物2(5.3 mg)。Fr.13經過ODS開放柱梯度洗脫(甲醇-水1∶5→100∶0)，得到個子餾分Fr.13-1～Fr.13-8，其中Fr.13-6經半制備液相色譜(甲醇/水55∶45)制備得到化合物1(7.8 mg)。Fr.15經硅膠柱洗脫(二氯甲烷/甲醇100∶0→0∶100)，并且經TLC合并得到10個子餾分Fr.15-1～ Fr.15-10，其中Fr.15-5再經過ODS開放柱多梯度洗脫(甲醇-水1∶5→100∶0)得到Fr.15-5-1，該餾分經半制備液相色譜(甲醇/水45∶55)制備得到化合物4(7 mg)。Fr.15-7經過Sephadex LH-20 凝膠色譜柱以純甲醇系統洗脫，得到化合物5(5 mg)。

2.2 細胞培養

將小鼠巨噬細胞系RAW 264.7在DMEM培養基(含10%胎牛血清)中培育，培育條件為37 ℃、5% CO2，待細胞長滿培養皿底部的80%面積，將對數生長期的細胞取出用于實驗。

2.3 細胞活力測試

RAW 264.7細胞用DMEM培養液(含10%胎牛血清)到96孔板(4×104個細胞/孔，體積為100 μL/孔)。將細胞置培育箱中培養24 h(培育箱條件：37 ℃、5%CO2)后吸出培養液，加入待測化合物(不同濃度)及陽性對照藥(槲皮素)的培養液， 24 h 后將上清液除去，在96孔板中加入MTT (5 mg/mL/孔)，溫度為37 ℃，4 h后棄去MTT，加入DMSO (200 μL/孔)，置搖床上低速震蕩10 min，在觀察到結晶充分溶解后，在570 nm處用酶標儀測量各孔的OD值，計算化合物的IC50值[8]。

2.4 抗炎活性測試

本實驗中通過抑制一氧化氮(NO)生成實驗檢測化合物抗炎活性，檢測模型為小鼠巨噬細胞RAW 264.7(LPS誘導)，采用Griess試劑顯色法評估一氧化氮生成量。將RAW 264.7細胞用DMEM培養液(10%胎牛血清)稀釋，之后接種到96孔板(4×104個細胞/孔，每孔體積100 μL)。在37 ℃、5%CO2的恒溫培育箱培育24 h后，吸出培養液，加入待測化合物(不同濃度)及陽性對照藥(槲皮素)的培養液(培養液中預先加入100 ng/mL LPS)。再經24 h后，將各孔上清液吸出，移至新的96孔板，每孔加入100 μL混合溶液(Griess A：B為1∶1)。離心1 min(3000 rpm)后移至黑暗處反應10 min。在540 nm波長下用酶標儀測定各孔OD值，計算化合物的IC50值[8]。

3 實驗結果

3.1 化合物結構鑒定

化合物1黃色油狀(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z352.114 9 [M + Na]+,確定其相對分子質量為329，分子式為C18H19NO5;1H NMR (300 MHz,CD3OD)δ:6.46 (2H,d,J=15.9 Hz,H-2),7.44 (2H,d,J=15.6 Hz,H-3),3.44 (1H,dd,J=5.1,13.5 Hz,H-1′a),3.54 (1H,dd,J=5.1,13.5 Hz,H-1′b),4.73 (1H,dd,J=4.8,7.8 Hz,H-2′),7.11 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2″),6.81 (1H,d,J=5.4 Hz,H-5″),7.02 (1H,dd,J=2.1,8.1 Hz,H-6″),7.22 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2″′,6′″),6.78 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′″,5″′),3.87 (3H,s,4′″-OCH3);13C NMR (75 MHz,CD3OD) δ:169.5 (C-1),118.6 (C-2),142.2 (C-3),48.3 (C-1′),73.4 (C-2′),134.7 (C-1″),111.5 (C-2″),149.9 (C-3″),149.3 (C-4″),116.5 (C-5″),123.3 (C-6″),128.2 (C-1′″),128.4 (C-2′″,6′″),116.1 (C-3′″,5′″),158.1 (C-4′″),56.4 (4′″-OCH3)。以上數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定化合物1為N-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxyethyl]-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide。

化合物2淡黃色粉末(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z366.132 9 [M + Na]+,確定其相對分子質量為343，分子式為C19H21NO5;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:3.47 (2H,dd,J=8.1,13.8 Hz,H-1′),3.89 (3H,s,3′″-OCH3),3.22 (3H,s,2′-OCH3),4.25 (1H,dd,J=4.2,8.4 Hz,H-2′),7.13 (1H,d,J=4.2 Hz,H-2′″),6.80 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3″,5″),6.79 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5″′),6.48 (1H,d,J=15.6 Hz,H-2),7.03 (1H,dd,J=1.8,8.4 Hz,H-6′″),7.17 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2″,6″),7.44 (1H,d,J=16.2 Hz,H-3);13C NMR (150 MHz,CD3OD) δ:47.1 (C-1′),56.4 (3′″-OCH3),56.8 (2′-OCH3),83.3 (C-2′),111.5 (C-2′″),116.3 (C-3″,5″),116.5 (C-5′″),118.6 (C-2),123.3 (C-6′″),128.3 (C-1′″),129.2 (C-2″,6″),131.4 (C-1″),142.2 (C-3),149.3 (C-3′″),149.9 (C-4′″),158.6 (C-4″),169.2 (C-1)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物2為3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-[2-(4-hydroxyphenyl)-2-methoxyethyl]acrylamide。

化合物3白色粉末(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z298.111 0 [M- H]-,確定其相對分子質量為299，分子式為C17H17NO4;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:3.43 (1H,dd,J=7.8,13.8 Hz,H-1′a),3.53 (1H,dd,J= 3.6,13.8 Hz,H-1′b),4.72 (1H,dd,J=4.8,7.8 Hz,H-2′),6.78 (2H,d,J=8.4 Hz,H-5′,7′),6.78 (1H,d,J= 9 Hz,H-6,8),6.44 (1H,d,J=15.6 Hz,H-2),7.22 (2H,d,J=9.0 Hz,H-4′,8′),7.41 (2H,d,J=9 Hz,H-5,9),7.45 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-3);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:47.8 (C-1″),73.5 (C-2′),116.1 (C-5′,7′),116.7 (C-6,8),118.3 (C-2),127.7 (C-4),128.5 (C-4′,8′),130.6 (C-5,9),134.7 (C-3′),142.0 (C-3),158.1 (C-7),160.6 (C-6′),169.6 (C-1)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為N-trans-coumaroyloctopamine。

化合物4黃色油狀(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z658.273 5 [M + Na]+,確定其相對分子質量為635，分子式為C34H41N3O9;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.35 (2H,s,H-3),7.58 (1H,s,H-8),6.84 (1H,s,H-2′),6.59 (1H,s,H-5),2.48 (2H,m,H-2),2.23 (2H,m,H-4′,8′),6.94 (2H,d,J=16.8 Hz,H-2″,6″),6.68 (2H,d,J=16.8 Hz,H-3″,5″),2.60 (2H,t,J=14.4 Hz,H-7″),3.22 (2H,m,H-8″),3.14 (2H,m,H-1′″),1.48 (4H,br.s,H-2″′),3.24 (2H,m,H-4″′),1.91 (3H,s,N-COCH3),3.57 (6H,s,3′,5′-OCH3);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:127.1 (C-1),109.0 (C-2,6),148.7 (C-3,5),138.0 (C-4),138.4 (C-7),132.6 (C-8),170.6 (C-9),132.3 (C-1′),118.2 (C-2′),147.3 (C-3′),146.2 (C-4′),118.3 (C-5′),127.1 (C-6′),29.8 (C-7′),37.7 (C-8′),175.0 (C-9′),131.2 (C-1″),130.7 (C-2″,6″),116,2 (C-3″,5″),156.8 (C-4″),35.6 (C-7″),42.3 (C-8″),40.2 (C-1),27.7 (C-2),28.0 (C-3),40.6 (C-4),173.6 (N-COCH3),22.6 (N-COCH3),56.3 (3′,5′-OCH3)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為(E)-2-(4,5-dihydroxy-2-{3-[(4-hydroxyphenethyl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-N-(4-acetamidobutyl)acrylamide。

化合物5白色粉末(DMSO)；HR-ESI-MS:m/z641.251 1 [M + H]+,確定其相對分子質量為640，分子式為C36H37N2O49;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:4.61 (1H,s,H-1),3.58 (1H,s,H-2),7.28 (1H,s,H-4),6.73 (1H,s,H-5),6.37 (1H,d,J=2.4 Hz,H-2′),6.54 (1H,d,J=6.4 Hz,H-5′),6.28 (1H,dd,J=2.4,6.4 Hz,H-6′),6.87 (2H,d,J=6.4 Hz,H-2″′,6′″),6.62 (2H,d,J=6.4 Hz,H-3″,5″),6.66 (2H,d,J=6.4 Hz,H-3′″,5′″),6.96 (2H,d,J= 9.0 Hz,H-2″,6″),3.23 (2H,m,H-α),3.10 (2H,m,H-α′),2.61 (2H,t,J=7.2 Hz,H-β),2.46 (2H,t,J=7.2 Hz,H-β′),3.83 (3H,s,6-OCH3),3.47 (3H,s,8-OCH3),7.68 (1H,t,J=7.2 Hz,-NH),8.15 (1H,t,J=7.2 Hz,-NH′);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:38.8 (C-1),47.3 (C-2),126.4 (C-3),132.0 (C-4),107.7 (C-5),147.2 (C-6),141.0 (C-7),145.7 (C-8),122.7 (C-4a),124.2 (C-8a),170.7 (C-2a),167.3 (C-3a),134.7 (C-1′),115.1 (C-2′),143.5 (C-3′),144.6 (C-4′),115.1 (C-5′),118.1 (C-6′),129.6 (C-1″,1″′),129.5 (C-2′″,6′″),115.1 (C-3″,5″),155.6 (C-4″,4′″),115.1 (C-3′″,5′″),129.5 (C-2″,6″),40.1 (C-α),40.3 (C-α′),34.3 (C-β),34.4 (C-β′),56.8 (6-OCH3),60.8 (8-OCH3)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物5為1,2-dihydro-6,8-dimethoxy-7-hydroxy-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-N1,N2-bis[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-2,3-naphthalene dicarboxamide。

化合物6無色油狀(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z441.151 2 [M + Na]+,確定其相對分子質量為418，分子式為C22H26O8;1H NMR (300 MHz,CD3OD)δ:3.14 (2H,m,H-1,5),3.84 (1H,s,H-4b,8b),3.87 (12H,m,3′,5′,3″,5″-OCH3),4.26 (2H,m,H-4a,8a),4.71 (2H,d,J=6.4 Hz,H-2,6),6.66 (4H,d,J=6.4 Hz,H-1′,6′,1″,6″);13C NMR (75 MHz,CD3OD)δ:55.5 (C-1,5),56.8 (C-3′,5′,3″,5″-OCH3),72.8 (C-4,8),87.6 (C-2,6),104.5 (C-2′,6′,2″,6″),133.1 (C-1′,1″),136.1 (C-4′,4″),149.3 (C-3′,5′,3″,5″)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物6為(+)-syringaresinol。

化合物7白色粉末(DMSO)；HR-ESI-MS:m/z281.102 1 [M + H]+,確定其相對分子質量為280，分子式為C14H16O6;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:3.13 (1H,m,H-5),3.59 (1H,m,H-1),3.75 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.93 (1H,d,J=9.2 Hz,H-4b),4.20 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8b),4.35 (1H,d,J=7.6 Hz,H-4a),4.48 (1H,d,J=7.6 Hz,H-8a),4.62 (1H,d,J=10.4 Hz,H-6),6.63 (2H,s,H-2′,6′);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ:45.9 (C-5),48.4 (C-1),56.3 (C-3′,5′-OCH3),69.7 (C-8),70 (C-4),86.3 (C-6),102.8 (C-2′,6′),129.8 (C-1′),134.9 (C-4′),147.3 (C-3′,5′),178 (C-2)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物7為zhebeiresinol。

化合物8黃棕色固體(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z289.071 7 [M- H]-,確定其相對分子質量為288，分子式為C15H12O6;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:2.70 (1H,d,J=12.6 Hz,H-3β),3.07 (1H,d,J=12.6 Hz,H-3α),5.29 (1H,t,J=12.6 Hz,H-2),5.88 (1H,s,H-8),5.90 (1H,s,H-6),6.92 (1H,s,H-2′),6.79 (2H,d,J=1.8 Hz,H-5′,6′);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:44.1 (C-3),80.5 (C-2),96.2 (C-8),97.0 (C-6),103.3 (C-10),114.7 (C-2′),116.2 (C-5′),119.2 (C-6′),131.8 (C-1′),146.5 (C-3′),146.9 (C4′),164.8 (C-9),165.5 (C-5),168.4 (C-7),197.7 (C-1)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物8為(±)-eriodictyol。

化合物9白色粉末(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z153.054 8 [M + H]+,確定其相對分子質量為152，分子式為C8H8O3;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:9.75 (1H,s,-CHO),7.46 (1H,s,H-2),7.44 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.95 (1H,d,J=7.6 Hz,H-6),3.94 (3H,s,4-OCH3);13C NMR (100 MHz,CD3OD)δ:56.4 (4-OCH3),111.2 (C-2),116.4 (C-6),128.0 (C-5),130.4 (C-1),149.8 (C-3),155.2 (C-4),192.0 (C-1′)。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物9為isovanilin。

化合物10白色粉末(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z247.090 2 [M + H]+,確定其相對分子質量為246，分子式為C14H14O4;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.44 (2H,br.s,2,2′-OH),6.77 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,3′),7.02 (2H,d,J=8.4 Hz,H-4,4′),7.11 (2H,s,H-6,6′),3.88 (6H,s,5,5′-OCH3);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:127.7 (C-1,1′),150.4 (C-2,2′),116.3 (C-3,3′),123.9 (C-4,4′),149.2 (C-5,5′),111.6 (C-6,6′),56.3 (5,5′-OCH3)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物10為5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol。

化合物11黃色粉末(CH3OH)；HR-ESI-MS:m/z315.141 7 [M + H]+,確定其相對分子質量為314，分子式為C18H18O5;1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:2.76 (1H,t,J=7.8 Hz,H-2″),3.46 (1H,t,J=6.6 Hz,H-1″),3.88 (1H,s,3-OCH3),7.12 (2H,s,H-2),6.72 (1H,d,J=12.8 Hz,H-3′,5′),6.80 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.40 (1H,d,J=8.4 Hz,H-8),7.02 (2H,d,J=7.2 Hz,H-6),7.05 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-2′,6′),7.43 (1H,d,J=13.6 Hz,H-7′);13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:35.8 (C-2″),42.5 (C-1″),56.4 (3-OCH3),111.5 (C-2),116.3 (C-3′,5′),116.5 (C-5),118.7 (C-8),123.2 (C-6),128.3 (C-1),130.7 (C-2′,6′),131.3 (C-1′),142.0 (C-7),149.3 (C-3),149.8 (C-4),156.9 (C-4′),169.2 (C-9)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物11為p-hydroxyphenethyltrans-ferulate。

化合物12白色粉末(CHCl3)；HR-ESI-MS:m/z581.451 9[M + Na]+,確定其相對分子質量為558，分子式為C36H62O4;1H NMR (300 MHz,CDCl3)δ:0.88 (3H,t,J=6.3 Hz,H-26′),1.70 (2H,m,H-2′),3.91 (3H,s,3-OCH3),4.19 (2H,t,J=12.6 Hz,H-1′),7.02 (1H,s,H-2),6.91 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),7.06 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),7.61 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7),6.29 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3),5.98 (1H,s,-OH),1.25 (46H,br.s,(CH2)23);13C NMR (75 MHz,CDCl3)δ:14.3 (C-26′),22.8 (C-25′),26.1 (C-3′),28.9 (CH2),29.4 (CH2),29.5 (CH2),29.7 (CH2),29.7 (CH2),29.8 (CH2×2),29.8 (CH2×14),32.1 (C-1),56.0 (3-OCH3),64.7 (C-1′),109.4 (C-2),114.8 (C-5),115.7 (C-8),123.1 (C-6),127.1 (C-1),144.8 (C-7),146.9 (C-3),148.0 (C-4),167.5 (C-9)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物12為E-ferulic acid hexacosyl ester。

3.2 細胞活力及抗炎活性實驗結果

從寧夏枸杞根及莖中分離得到的12個化合物(1～12)的細胞毒活性和抗炎活性結果見表1。具有顯著抗炎活性的為化合物2，其IC50值為17.00 ± 1.11 μmol/L，小于陽性對照藥槲皮素(IC50=17.21 ± 0.50 μmol/L)。比較化合物2和3的結構與活性，可初步推測該類化合物抑制NO生成的活性與R2、R3上的取代基團有關，本研究選取了與化合物2具有相同骨架的化合物13、14，進一步測試了它們的細胞毒活性與抗炎活性，結果發現具有阿魏酰酪胺骨架的一類化合物，R3上的取代基團是其抗炎活性的關鍵，其活性大小關系為：R3為甲氧基 > R3為氫取代 > R3為羥基，且當R3上為羥基取代時，化合物無抗炎活性。

表1 化合物1～14的細胞毒活性和抗炎活性

注：陽性對照藥為槲皮素，化合物13為N-trans-feruloyltyramin，14為(2S,E)-N-[ 2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide其結構見圖1。Note:Quercetin was used as positive control,compound 13 is N-trans-feruloyltyramin,and 14 is (2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide.Their structures are shown in Fig 1.

4 結論

本研究從寧夏枸杞根和莖部分離鑒定了12個化合物，均為首次從該植物中分離得到。此外，對這12個化合物進行了細胞毒活性和抗炎活性測試，發現化合物2具有明顯的抗炎活性，其活性略強于陽性對照藥槲皮素。通過比較化合物2、3、13、14的活性結果，推測具有阿魏酰酪胺骨架的一類化合物，R3上的取代基團是其抗炎活性的關鍵，其活性大小關系為：R3為甲氧基 > R3為氫取代 > R3為羥基，且當R3上為羥基取代時，化合物無抗炎活性。本研究結果為后續尋找寧夏枸杞中具有抗炎活性的天然活性成分提供了一些科學依據，豐富了醫藥和天然產物開發提的理論基礎。