內蒙古興安盟地區布魯氏菌流行株種型鑒定和體外藥物敏感性分析

袁海濤,崔建楠,彩 花,馮麗平,王 紅,郭長山,吳金泉,劉偉雙,曲振紅,蔡洪濤

布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病),是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌引起的一種人獸共患病。布病給流行國家和地區造成經濟損失并危害人類健康[2]。2018年興安盟地區人間布病發病人數和發病率均居于內蒙古自治區各盟市首位,布病防控工作形勢嚴峻,目前對內蒙古興安盟地區布病患者的感染菌種型及細菌對常用藥物的敏感性的研究,尚未見報道。該研究選擇興安盟布病發病率較高的3個旗縣和1個人口密集的旗縣分離的布魯氏菌,明確布魯氏菌流行的主要種型,了解菌株的耐藥菌譜,為臨床治療提供指導。

1 材料與試劑

1.1 菌株來源 28株布魯氏菌是2018年5月-12月,從興安盟地區200名布病患者血樣中分離培養獲得,其中科右中旗9株,突泉縣8株,科右前旗6株,烏蘭浩特市4株,扎賚特旗1株。3株標準菌株羊16M、牛544A、豬1330S來源中國疾病預防控制中心;藥敏質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213,來源于溫州市康泰生物科技有限公司。

1.2 試劑 布氏瓊脂肉湯(批號8129671)由美國BD公司生產,布氏瓊脂(批號7121860)由美國BD公司生產,32GN陰性桿菌鑒定卡(批號2410565203)由法國梅里埃公司生產,BCSP31基因的PCR檢測試劑(批號:EB05KAC422),由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,布魯氏菌鑒定用用噬菌體Tb、Tb104RTD、BK2,單項特異性血清A和M由中國疾病預防控制中心提供,藥敏板包括13種抗生素:鏈霉素、多西環素、利福平、四環素、阿奇霉素、環丙沙星、復方新諾明、頭孢曲松、氧氟沙星、莫西沙星、妥布沙星、慶大霉素,由溫州市泰康生物科技有限公司生產(批號RL14140)。藥敏試驗使用肉湯微量稀釋MIC法,試驗程序和結果判讀按臨床和美國實驗室標準化研究所(CLSI)制定的抗菌藥物敏感性執行標準進行。

1.3 樣本的采集、培養和分離 病人樣本的采集:無菌方法用BD BACTEC血培養瓶采集疑似布病病人血液樣本8～10 mL,置于美國BD FX-40全自動血培養系統中培養7 d,當細菌生長時自動提示,若無細菌生長,血培養瓶高壓處理。將陽性血培養瓶中培養液接種于血平皿上,至37℃溫箱中培養2 d后觀察和分離典型菌落。

1.4 布魯氏菌的鑒定

1.4.1 顯微鏡檢查 將可疑菌落涂片用甲醛固定后進行革蘭染色,用油鏡觀察。

1.4.2 布魯氏菌屬的鑒定[3]生化鑒定:將純菌配置成0.5麥氏濁度的菌懸液,使用32GN陰性桿菌鑒定卡,通過VITEK2 COMPACT全自動微生物分析系統進行生化鑒定。分子生物學鑒定:用世界動物衛生組織(OIE)推薦的BCSP31基因的PCR方法[4],在屬的水平上檢測和鑒定布魯氏菌菌株。ABT PCR毛細管電泳系統檢測。

1.4.3 布魯氏菌種型的鑒定 通過染料抑制試驗(染料濾紙片方法)、CO2需求試驗、H2S生成試驗、單因子血清凝集試驗(A和 M)、噬菌體Tb、Tb104RTD、BK2裂解實驗鑒定布魯氏菌的生物種型。

1.5 藥敏試驗[5-7]

1.5.1 方法依據 采用2018CLSI-M100-S28和WST 639-2018推薦的肉湯微量稀釋法。使用不含添加劑的布魯氏肉湯p H7.0±0.2。

1.5.2 試驗方法 無菌操作,選取布氏瓊脂平板上純培養菌落,被測菌株和相應質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213配制0.5麥氏濁度單位的菌懸液,作為初始接種物菌懸液。制備濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液,經1∶200稀釋后,向每孔中加100μL(最終接種物濃度約為5×104CFU/mL),密封后置35℃普通空氣孵箱中,孵育48 h觀察結果。以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔(即不含抗生素)內細菌明顯生長試驗成立。記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度MIC值。

2 結 果

2.1 培養和分離 200份血培養瓶28份儀器報警陽性,28份樣本在血平皿上生長為較小,灰色,圓形,稍隆起,邊緣整齊,不溶血的小菌落。

2.2 鑒定結果

2.2.1 顯微鏡檢查 28株菌革蘭染色,油鏡觀察細菌的形態為陰性球桿菌、染色弱、細沙樣。

2.2.2 生化鑒定 28株菌經 VITEK2 COMPACT全自動微生物分析系統鑒定均為布魯氏菌屬(表1)。

表1 28株布魯氏菌生化鑒定結果Tab.1 Biochemical identification results of Brucella(28 strains)

2.2.3 分子生物學鑒定 28株菌經BCSP31-PCR擴增后,用毛細管電泳均有清晰的約223 bp大小的基因片段。

2.2.4 種型鑒定 用傳統經典的方法進行種型鑒定,28株布魯氏菌H2S試驗、Tb噬菌體裂解試驗、Tb104RTD噬菌體裂解試驗均為陰性,Bk2噬菌體裂解試驗、硫堇抑菌試驗、復紅抑菌試驗均為陽性,通過試驗判定28株菌均為布魯氏菌羊種。進一步通過A M R血清凝集鑒定羊布魯氏菌的菌型(表2),結果顯示:羊種布魯氏菌為興安盟主要的流行株,其中羊種3型最多(64.29%),羊種1型其次(35.71%),見表2。

2.2.5 藥敏結果 本研究對28株布魯氏菌分離株中的25株菌(3株菌送中國疾控中心,未留藥敏試驗菌株)進行了體外藥物敏感性研究,按照CLSI規定的MIC的結果判定方法,本次使用的藥敏質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213,對各藥物的MIC檢測值在CLSI規定的標準菌株質控值允許的范圍內。

表2 28株布魯氏菌種型鑒定結果Tab.2 Species identification of Brucella(28 strains)

25株菌均分離自病人血液樣本;初診患者占78.57%(22/28),臨床表現以發熱、多汗、關節疼痛、頭痛、乏力居多;75.00%(21/28)的患者就診前無用藥史,25.00%(7/28)的患者就診前用過左氧氟沙星、頭孢曲松或中蒙藥等藥物治療,見表3。

實驗結果表明25株布魯氏菌對阿奇霉素、復方新諾明耐藥菌株數分別為100%(25/25)和20.0%(5/25);部分菌株對利福平、頭孢曲松的藥物敏感性降低[10],均為16%(4/25)。所有菌株對多西環素、四環素、慶大霉素、鏈霉素均表現為敏感,妥布霉素、卡那霉素找到或未在文獻中搜索到判定標準,其檢測的MIC值僅為相關研究提供一些參考。

3 討 論

由于布魯氏菌的致病性以及既往實驗室感染的報道,所有標本的處理均應在二級及以上級別的生物安全柜內進行,疑似布魯氏菌涂片染色前要用甲醛固定(以殺滅布氏菌)再進行涂片[1]。

本研究分離布魯氏菌28株經VITEK2COMPACT全自動微生物分析系統鑒定均為布魯氏菌屬。全自動微生物分析系統鑒定速度快,可靠性較高,確定布魯氏菌屬的鑒定指標為L-脯氨酸芳胺酶(Pro A)、酪氨酸芳胺酶 (Tyr A)、尿素酶(URE)、氨基乙酸芳胺酶(Gly A);區分羊種布氏菌的指標為ELLMAN(ELLM)[3]。

鑒于目前,仍沒有一種PCR方法可以將所有的布魯氏菌鑒定到型[8],本研究所有布魯氏菌菌株的分型均基于傳統的微生物方法(生長、產尿素酶和硫化氫、對染料堿性品紅和硫蛋白的敏感性以及噬菌體Tiblissi和 Weybridge的分解)[9]。傳統的微生物方法對布魯氏菌種型鑒定方法對布魯氏菌進行生物種型鑒定,證實羊種布魯氏菌為興安盟主要的流行株,其中羊種3型最多(64.29%),其次是羊種1型(35.71%)。與2018年內蒙古烏蘭察布市地區布魯氏菌分型特征相似,其研究共分離布魯氏菌116株,其中115株分離自人血,1株分離自羊脾;經3種方法鑒定全部為羊種布魯氏菌,其中羊3型94株,羊1型22株;菌株分布于烏蘭察布市境內的11個旗(縣、市、區)及周邊的內蒙古錫林郭勒盟、山西省大同市郊和河北省尚義縣等地[10]。

本次研究的內蒙古興安盟地區布魯氏菌流行株對一線方案藥物多西環素、慶大霉素、鏈霉素、四環素敏感;部分菌株對利福平、頭孢曲松的藥物敏感性下降,國外有文獻報道,布魯桿菌對利福平的敏感性降低,我國尚無關于耐藥性的大規模研究[1]。由于CLSI尚未確定布魯氏菌種MIC的折點,這些菌株不能自信地描述為中間抗性,盡管可能存在易感性降低。利福平的MIC值在1到4 mg/L之間已經報道過。SXT也得到了類似的結果[9]。本研究根據CLSI慢生細菌的解釋標準,4株對利福平的MIC值為1.6 mg/L,為藥物敏感性降低的菌株;25株菌對阿奇霉素全部耐藥,這與2011年中國疾病預防控制中心對國內分離的69株羊種布氏菌進行12種抗生素的體外敏感性研究中對阿奇霉素、克拉霉素全部耐藥的報告一致[5]。部分菌株對復方新諾明耐藥,與2018年內蒙古烏蘭察布地區的臨床常用藥物的敏感性研究一致,其實驗表明布魯氏菌對阿奇霉素、利福平和復方新諾明耐藥菌株數分別為100%(85/85),1.0%(1/85)和7.0%(6/85)[10]。不同的是,根據CLSI慢生細菌的解釋標準,本研究中的4株菌對頭孢曲松的MIC值為4.0 mg/L,可能為藥物敏感性降低的菌株。我國是抗菌藥物應用大國,耐藥性問題不容忽視,有待較大規模的調查以明確我國布魯氏菌的耐藥現狀。

表3 25株布魯氏菌體外藥敏試驗結果Tab.3 drug sensitivity test of Brucella(25 strains)

利益沖突:無

引用本文格式:袁海濤,崔建楠,彩花,等.內蒙古興安盟地區布魯氏菌流行株種型鑒定和體外藥物敏感性分析[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):826-830.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.102