人工角膜載體的體外構建及生物相容性研究△

張行 張毅 吳迪 高維奇 關立南

全世界超過1000萬人正承受著角膜盲的痛苦[1]，目前角膜移植存在的一個主要問題就是供體短缺。而創建組織工程角膜卻極具挑戰性，因為它不僅需要構建膜性載體，還要保證其透明性、機械穩定性和生物相容性。為了解決這些難題，研究人員開始嘗試把各類與角膜成分相似的生物材料用于人工角膜載體的合成，而載體所形成的三維結構不僅要能為細胞代謝、獲取營養和生長提供有利空間，也為植入的細胞最終形成相應的組織或器官提供良好的微環境[1]。本研究選用天然材料中的蠶絲蛋白(silk fibroin，SF)和貝殼中提取的殼聚糖(chitosan，CS)作為原料。SF可以從家蠶的繭中大量提純其絲素[2-3]，被廣泛應用于各種組織工程材料中，如運藥載體膠囊[2]、關節骨科及韌帶的結締組織替代物[4]等。CS是一種甲殼素衍生材料，因其獨特的黏彈性被廣泛用于藥物載體和眼科實踐中[5]。因此，本研究應用SF和CS共同制成載體膜片，用其構建組織工程角膜基質并評估該膜的各項生物特性，進一步研究不同比例SF和CS共混膜片的物理特性。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級成年新西蘭白兔33只(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心提供)，體質量1.5～2.0 kg，飼養溫度(22±2)℃,濕度40%～70%,自然光照,自由進食與飲水。用于角膜移植及細胞培養。蠶絲原料由浙江嘉興絲綢有限公司贈送；高脫乙酰度殼聚糖購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 角膜上皮及基質細胞培養無菌條件下取直徑6.0 mm的兔角膜中央部組織，留距角膜緣內外約1 mm的角膜和鞏膜組織，于37 ℃、含體積分數5%CO2飽和濕度的條件下，內皮層向下置于六孔板培養；剩余部分消化后去除上皮層、內皮層和后彈力層，將其切成1～2 mm小膜片離心后置于培養基中，37 ℃恒溫、體積分數5% CO2環境下孵育，每2 d換液1次。

1.2.2 細胞鑒定將培養在六孔板中的原代兔角膜上皮及基質細胞部分取出，用BCA試劑測定蛋白濃度。SDS-PAGE方法分離轉移，放于10 mL體積分數2%BSA封閉液中，4 ℃封閉過夜；一抗二抗反應后，LabWorksTM 掃描定量。

1.2.3 SF/CS共混膜合成分別獲取100 g·L-1SF溶液和36.6 g·L-1CS溶液；將SF和CS按體積比31和41混合，制成混合液；透析凍干，浸入NaOH和甲醇混合溶液中15 min，再用1 mol·L-1NaOH替換，12～18 h后濾除溶液；中和酸堿度至pH值為7.2～7.4。最后浸泡消毒，用于體外細胞接種和體內植入。

1.2.4 載體膜片的構建取直徑8.5 mm共混膜消毒滅菌，將滅菌后的膜片置于細胞培養池上層，取出角膜基質細胞的培養基，滴于植片表面，平均10個位點，接種密度約為4000個·mm-2；替換培養基，禁忌沖洗，每2 d換液1次，共培養7 d；將大小約2.0 mm×1.0 mm角膜緣組織塊置于膜片頂部，并將上皮面向上培育14 d；顯微鏡下觀察細胞培養情況。

1.2.5 CCK-8法檢測載體膜片的毒性96孔板中設調零孔、對照孔和加藥孔，調零孔加培養基、CCK-8，對照孔和加藥孔均加細胞、培養液、CCK-8，加藥孔多加入載體膜。采用單因素方差分析檢測各孔的吸光度(A)值，正常培養板為對照組，通過觀察加入載體膜后1 d、3 d、5 d、7 d的貼壁細胞數量檢測細胞的黏附性。

1.2.6 載體膜片植入動物模型的構建隨機分組法分出正常對照組、SF/CS 31角膜移植組(A組)、SF/CS 41角膜移植組(B組)和羊膜移植組(C組)。術前4 h氯霉素滴眼液滴眼,慶大霉素生理鹽水沖洗結膜囊；用30 g·L-1戊巴比妥鈉按30 mg·kg-1體質量兔耳緣靜脈注射麻醉，倍諾喜滴眼液滴眼2次行眼表面麻醉。6.5 mm環鉆于兔角膜中央做標記，取載體膜片5.0 mm置于復方氯化鈉溶液中培養待用，在距角膜緣至少4.0 mm角膜印記處用15°尖刀加深切口約1/2角膜厚度，徑口寬度約為5.0 mm；虹膜恢復器探入切口鈍性分離成直徑6.5 mm的口袋式板層角膜切口；將膜片平鋪于口袋中，10-0尼龍線縫合1針，線結隱蔽，慶大霉素和地塞米松結膜下注射，術后單籠飼養，典必殊眼膏涂眼，14 d拆除縫線，裂隙燈下觀察兔角膜病情變化。

1.2.7 觀察排斥反應及判斷標準參照Sonoda等方法[6]。術后14 d內每天裂隙燈下觀察，第15天起每2 d一次，評估角膜混濁和新生血管化程度，觀察時間為90 d。排除感染、前房出血及其他原因引起的死亡。記錄載體膜片完全降解是否出現排斥反應及出現排斥反應的時間和數量，并進行分析。

1.2.8 HE染色組織學檢查在SF/CS 31和41兩組中，隨機選出帶有角膜基質細胞的合成膜各3個。40 g·L-1多聚甲醛固定1 h，沿角膜緣剪取角膜，沖洗、脫水，石蠟包埋，厚5 μm切片，干燥，HE染色后光鏡下檢查。

1.2.9 移植后角膜切片免疫組織化學染色分析各組隨機選取2只白兔，移植術后2周、1個月、2個月、3個月采取氣體栓塞法處死，去除眼球。顯微鏡下沿角膜緣取角膜，獲取厚度為5 μm的切片，每個角膜連續獲取20～30張切片，按順序編號，每眼隔2個序列取切片4張，免疫組織化學染色，倒置顯微鏡下鏡檢。

1.3 統計學分析應用SPSS 20.0統計軟件進行分析處理。體外實驗各組間比較采用t檢驗。各組間植片存活時間差異采用One-Way ANOVA分析進行比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 載體膜片物理性質的檢測結果兩種膜片的透光率均>60%，說明該載體膜片透光性良好，但與正常的角膜組織間還存在明顯差異。兩種膜片的吸水性均>90%,明顯強于正常角膜(80%)。SF/CS 31的膜片抗張強度為(0.90±0.02)MPa，SF/CS 41膜片為(1.30±0.05)MPa，隨膜片中SF增多，抗張強度增強，但均低于正常角膜組織(3.8 MPa)。

2.2 兔上皮細胞、角膜基質細胞和膜材料的共培養

2.2.1 與基質細胞的共培養細胞生長良好，沒有細胞聚集或脫落的情況，且與膜片間具有良好的相容性，接種48 h后，少量細胞延伸至膜外。HE染色顯示，2周后細胞均勻遍布在各層支架網孔間；掃描電鏡可見，1周后細胞與載體膜片貼合良好，2周時可成片結合。見圖1。

圖1 載體膜片顯微結構。A：倒置顯微鏡下接種48 h后；B：HE染色接種2周后(圖中紅色條狀物為合成材料，藍色部分為細胞核染色)；C：掃描電鏡下培養1周后(×400)；D：掃描電鏡下培養2周后(×500)

2.2.2 角膜材料與兔角膜基質細胞和上皮細胞共培養HE染色可見，上皮細胞遷移至載體膜片，呈貼膜生長，且細胞體積大，胞質豐富(圖2A)。從組織的縱切面見上皮細胞為3～4層，層間緊密連接，且厚度類似天然兔角膜上皮細胞(圖2B)。在紅染膜片中可見共培養的兔角膜基質細胞，其細胞藍染，呈長梭狀，普遍較小，結構不清晰，并遍布于各層面。

2.3 載體膜片的毒性檢測結果通過CCK-8試劑盒檢測在兩種比例SF/CS載體膜上培養了1 d、3 d、5 d、7 d的活角膜基質細胞的A值，結果發現細胞在膜片上的狀態良好，能夠正常生長繁殖。且各組的細胞活性與時間呈正相關，這與細胞增殖數量有關，各組間的細胞活性檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖2 HE染色顯示2種細胞與SF/CS共培養結果。A:HE染色顯示上皮細胞在膜表面呈分層生長，膜內可見分布的細胞(×40)；B:貼膜生長的角膜上皮細胞類似于角膜緣處的上皮細胞(×40)

表1 各組角膜基質細胞不同時間的細胞活性

2.4 體內組織相容性的檢測結果

2.4.1 排斥反應的臨床觀察

2.4.1.1 術后1個月排斥反應臨床觀察術后1個月各組角膜出現不同的表現：A組植片未出現明顯的降解,角膜始終保持透明；B組植片可見輕微降解，角膜始終保持透明；C組植片機化明顯，有輕度新生血管產生，角膜表現為透明度下降。見圖3。

圖3 新西蘭白兔角膜移植術后1個月手術顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

2.4.1.2 術后2個月排斥反應臨床觀察術后2個月各組角膜出現較為明顯的不一致表現:A組植片出現少量降解，角膜始終保持透明；B組植片可見明顯降解，角膜始終保持透明；C組植片機化更加明顯，部分出現前房炎癥反應，有明顯的新生血管產生，角膜表現為透明度進一步下降。見圖4。

2.4.1.3 術后3個月排斥反應臨床觀察術后3個月各組角膜出現不同的表現:A組植片仍有部分未降解，角膜始終保持透明；B組植片基本全部降解,角膜始終保持透明；C組植片表面白色機化包裹，大量新生血管產生，角膜透明度基本喪失。見圖5。

圖4 新西蘭白兔角膜移植術后2個月手術顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

圖5 新西蘭白兔角膜移植術后3個月手術顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

2.4.2 免疫組織化學染色結果對A組和B組術后各時間點檢測CD4+、CD8+、CD31+T細胞，結果均呈陰性；而C組角膜組織內出現新生血管結構，檢測CD31+T細胞呈陽性。

2.4.3 載體膜片體內降解度觀察載體膜片存活時間SF/CS 41約為120 d，SF/CS 31約為90 d，SF/CS 41載體膜片存活時間較SF/CS 31膜片長，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

在過去的研究中，SF/CS混合材料的應用在組織工程學中已有相關報道，如有益于干細胞、HepG2肝細胞和成纖維細胞的培養和生長[7-9]，骨組織重建和皮膚再生[10-12]。但目前還未報道過兩種成分比例不同對構建的組織工程是否有影響。所以，本實驗我們通過制成兩種不同比例的SF/CS載體膜片，觀察其表面結構、吸水能力、透光程度及抗拉強度，分析組織工程運用這兩種材料來構建角膜基質的可行性。結果表明，雖然比例不同，但它們均可形成適當的多孔形態，并且在縱切面上形成相對平行排列的結構，與天然角膜相似，同時還能增大膜的吸水率，但未明顯改善膜的力學特性和透光性，特別是抗拉強度，與天然角膜仍存在一定的差距。之前有研究表明，將CS的比例從25%增至75%，極限抗拉能力可增強，但彈性模量隨之下降[13]。因此我們推斷，材料自身松散的三維結構可能是導致力學特性降低的因素，而三維結構的變化主要取決于CS的含量。

組織工程生物材料需要具備良好的生物相容性，而材料表面的性質是影響生物相容性的重要因素，其表面性質優良能促進細胞附著，還能促進生物膜迅速再生長。本實驗中，我們先將傳代的角膜基質細胞均勻種植于多孔的SF/CS載體膜片上，再將原代角膜上皮組織塊貼覆在人工材料上，隨之分層培養。結果顯示，角膜基質細胞能均勻分布在膜片每個層面上，并隨時間再生。在接下來的實驗中，我們還發現，采取氣-液分界面培養法可以達到上皮細胞分層培養并促進其形成復層上皮，從而在體外成功模擬出天然角膜的板層結構。但不同比例成分的膜片對細胞活性的影響不顯著，這可能說明基質細胞黏附性與CS的比例沒有相關性。以上的研究結果說明，用SF/CS構建的載體膜片能培養出角膜細胞，這一結果體現出良好的細胞生物相容性。同時，我們構建的模型成功模擬出天然板層的生理結構，在體外建立出一個動態的培養模型系統。

以細胞為基礎構建的組織工程角膜，既強調角膜基質細胞能維持高度分化表型，還需有分泌膠原間質的能力。因為維持角膜透明除了排列規律的膠原纖維和均勻分布的蛋白多糖外，細胞的表型還起到關鍵作用。有研究報道，在涂有CS的材料表面培養球形的角膜基質細胞有助于細胞表型的維持[14]。我們之所以將SF和CS混合，不僅是因為CS可以促進SF形成多孔結構，還因為CS能以一種多糖成分混入其中，進一步來模擬出天然角膜基質的成分，我們希望它能提供一個良好的微環境，以供角膜基質細胞生長。在本研究中，我們發現培養的角膜基質細胞不僅具有良好的黏附性和再生能力，還可以保持細胞活性。與在塑料培養皿中培養的角膜基質細胞相比，在SF/CS載體膜片上培養的細胞有天然的星形細胞結構。

此外，用于構建組織工程角膜基質的載體，其降解速度必須要能匹配上新生組織生長速度，之前雖然有人研究過基質載體的降解性能，但還沒有研究報道合適的載體膜片降解時間。我們結合臨床醫師經驗，認為載體膜片較為合適的降解時間為3個月。我們選擇兔子為實驗動物，兔角膜基質植入SF/CS載體膜培養，結果顯示兔角膜保持透明，無炎癥反應，且安全降解吸收時間在3個月左右，SF含量高的膜片組，其降解時間延長，此結果說明角膜基質與載體膜間存在良好的相容性，且SF含量對載體膜降解度有一定的影響，降解時間與SF所占比例呈正相關。另外，使用組織工程化材料替換機體內組織或器官的過程中，經?？沙霈F或輕或重的炎癥排斥反應。據報道，與其他合成材料相比，SF/CS顯著的優勢可能在于降解產物的無毒性，其降解產物較少引起組織滲透壓和pH值的局部變化[15]。本實驗結果表明，這種載體膜既能夠耐受外科手術的強度，還能夠在角膜板層口袋中平整地展開。移植術后3個月內該材料幾乎沒有任何眼內感染的表現，無角膜混濁及新生血管或機化等任何排斥反應，植入載體膜片良好貼合于角膜組織，同時受體角膜細胞良好浸潤于膜片中。在膜片降解過程中，我們檢測了CD4+T及CD8+T細胞排斥反應標記物，結果均為陰性。這些結果表明，由SF和CS合成載體膜片，不僅擁有良好的生物相容性，同時其降解產物對受體組織不具有毒性，還能促進供體組織的修復和再生，因此作為組織工程角膜基質替代材料有巨大的潛能。

在本實驗中，我們研究并證明了SF/CS載體膜片在未來重建角膜基質方面具備巨大潛力，并更深層次地去探討兩種成分不同構成比例對共混膜物理特性的影響，同時發現CS具有調控支架細胞再生增殖的能力，說明CS還能廣泛應用于其他方面，如角膜缺損的修復。但是從應用于臨床的可行性來講，還面臨許多問題，這些問題還需要進一步探討研究，如何兼顧材料的透明性和力學特性、移入的組織是否能夠維持細胞的生理功能及浸潤在組織工程材料中的基質細胞是否具有分泌細胞外基質的功能等。目前，本研究為選擇角膜移植材料提供了一個新方向。