117份小麥種質中5個矮稈基因的分子檢測

陳向東，吳曉軍，胡喜貴，李 淦，姜小苓 ，李笑慧，李小利，胡鐵柱，茹振鋼

(河南科技學院小麥中心/河南省雜交小麥重點實驗室/現代生物育種河南省協同創新中心，河南新鄉 453003)

0 引 言

【研究意義】自20世紀60年代以來，以矮稈品種推廣和配套栽培方式提高了主要農作物的產量[1]。小麥矮稈種質資源是育成小麥矮稈品種的材料基礎，分析小麥種質中矮稈基因分布情況，發掘和鑒定新的優良矮稈基因，創制新種質，對提高小麥育種水平具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已命名并統一編號的普通小麥Rht矮稈基因有24個。這些矮稈基因中9個來源于自然變異，13個來源于物理化學誘變[2-5]。其中，在我國小麥育種中應用最廣泛的有來源于日本農林10號的Rht-B1b(Rht1)、Rht-D1b(Rht2)和日本赤小麥的Rht8、Rht9。另外，來自中國西藏地方品種大拇指矮的Rht-B1c(Rht3)和西安市農科所從“矮稈早”中選出的天然突變系矮變1號的Rht-D1c(Rht10)也有一定的育種應用。Rht基因一般是多效基因，不僅能夠降低小麥植株高度，而且有些還能影響產量等農藝性狀。Rht-B1b、Rht-D1b基因能夠顯著降低植株高度，當兩者同時存在時，降稈效應還能夠累加[6-7]。另外，兩者對提高小麥產量具有促進作用[8-9]。一方面表現為直接效應：Rht-B1b能夠提高單株的分蘗成穗率、單株粒數、單株粒重等，Rht-D1b能夠提高分蘗成穗率、穗粒數、經濟系數等；一方面表現為間接效應：Rht-B1b能夠增加旗葉和倒二葉面積，增強莖稈強度，Rht-D1b抗倒能力突出，補償了生物產量降低對產量的負面影響。Rht-B1c和Rht-D1c對產量具有負效作用，如生物產量降低、生長發育緩慢、易受干熱風影響和易早衰等[10-11]。Rht4、Rht5、Rht6 和Rht7 在降低植株高度的同時會大大降低糧食產量。Rht8對結實率、籽粒產量和地上部生物產量均有顯著的正向作用，能夠明顯縮短生育期，對不良環境有較強的適應性，但品質性狀表現較差[12]。Rht9在降低植株高度的同時會增加分蘗數，穗變短，但最終增加糧食產量[13]。Rht13是對 GA3敏感的矮稈基因，可以降低株高而不影響胚芽鞘長度和幼苗生長勢，同時可以增加穗粒數，在小麥遺傳改良中頗具應用潛力[14]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，小麥矮稈基因的分子標記研究取得了很大進展。1999年Peng等克隆出Rht-B1b和Rht-D1b的同源基因。2002年Ellis等設計出能夠對Rht-B1b和Rht-B1a及Rht-D1b和Rht-D1a等位基因精確檢測的STS引物。2005年Ellis等對Rht4、Rht5、Rht8、Rht9、Rht12和Rht13等矮稈基因進行精細定位，開發了緊密連鎖的分子標記。Korzun等和Worland等1998年發現利用SSR引物Xgwm261擴增得到的特異片段可以檢測Rht8基因的有無。這些緊密連鎖分子標記的開發對小麥育種中矮稈基因的利用起到了促進作用。近年來一些學者對部分國外、國內品種及種質資源進行了矮稈基因分子檢測，但選擇的分子標記多集中于Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8，對其它矮稈基因發掘和利用較少[15-19]。研究我國小麥主產區部分小麥品種中矮稈基因的分布?！緮M解決的關鍵問題】以我國小麥主產區117份小麥品種及種質為材料，利用矮稈基因分子標記進行檢測，分析矮稈基因的分布特點和發掘攜帶特定矮稈基因的新種質，為小麥育種提供技術支撐和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

117份供試材料均由河南科技學院小麥中心提供，包含國內推廣品種及中間品系等。其中，小偃22攜帶Rht-B1b和Rht8基因，鄭9023攜帶Rht-D1b基因，揚麥18含Rht8基因，中國春不含任何矮稈基因。

檢測Rht-B1a基因(野生型)所用的引物對為BF-WR1，可以擴增出一條長237 bp的條帶，檢測Rht-B1b基因(突變型，具有致矮作用)所用的引物對為BF-MR1，也同樣可以擴增出一條長237 bp的條帶。使用兩個引物對檢測同一個材料，擴增條帶的有無，是互補出現的。試驗以昝凱等報道的小偃22攜帶Rht-B1b和Rht8基因[19]作為對照。試驗中檢測Rht-D1a和Rht-D1b基因所用引物對分別是DF2-WR2和DF-MR2，兩者分別可以擴增出264 bp和254 bp的條帶，兩個引物對擴增條帶的有無也是互補出現的。試驗以王玉葉報道的鄭9023攜帶Rht-D1b基因[20]為對照。

試驗中檢測Rht8基因所用引物為Xgwm261，擴增片段長度為192 bp。試驗以王玉葉[20]報道的揚麥18攜帶Rht-D1b基因為對照。

1.2 方 法

1.2.1 田間株高調查

117份小麥材料連續多年種植于河南科技學院輝縣試驗田，每個材料種植2行，行距20 cm，株距10 cm，采用常規大田管理。在小麥成熟期測量株高，每個材料隨機測5株。

1.2.2 DNA提取

將每個材料5株小麥苗期葉片混合，采用CTAB法提取小麥基因組DNA，利用微量分光光度計測量DNA質量和濃度，并將DNA原液稀釋成50 ng/μL工作液，放至4℃冰箱保存備用。

1.2.3 PCR擴增

所用矮稈基因檢測引物均由上海Invitrogen英俊生物技術有限公司合成，引物序列、退火溫度、擴增片段長度等。表1

PCR反應體系：20 μL體系，包含2×TaqMaster Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)10 μL，10 μmol/L正反向引物各0.8 μL，50 ng/μL的模板DNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。使用ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀，擴增程序為95℃預變性 5 min；94℃變性30s，55～63℃退火30s，72℃延伸50s，35循環；72℃延伸5 min。Rht-B1a、Rht-B1b、Rht-D1a和Rht-D1b用1.2%的瓊脂糖(含goldview染料)進行電泳檢測，Rht8、Rht9、Rht13用2%瓊脂糖進行電泳檢測，再用凝膠成像系統觀察結果并拍照保存。

表1 所用的矮稈基因分子標記
Table 1 Molecular markers of dwarf genes used in this study

基因位點Gene loci標記Markers引物序列(5′-3′)Primer Sequence退火溫度Tm片段長度Production lengthRht-B1aBFGGTAGGGAGGCGAGAGGCGAGWR1CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTG63℃237 bpRht-B1bBFGGTAGGGAGGCGAGAGGCGAGMR1CATCCCCATGGCCATCTCGAGCTA63℃237 bpRht-D1aDF2GGCAAGCAAAAGCTTCGCGWR2GGCCATCTCGAGCTGCAC63℃264 bpRht-D1bDFCGCGCAATTATTGGCCAGAGATAGMR2CCCCATGGCCATCTCGAGCTGCTA63℃254 bpRht8Xgwm261-FCTCCCTGTACGCCTAAGGCXgwm261-RCTCGCGCTACTAGCCATTG55℃192 bpRht9BARC151-FTGAGGAAAATGTCTCTATAGCATCCBARC151-RCGCATAAACACCTTCGCTCTTCCACTC55℃220 bpRht13WMS577-FATGGCATAATTTGGTGAAATTGWMS577-RTGTTTCAAGCCCAACTTCTATT55℃130 bp

2 結果與分析

2.1 矮稈基因Rht-B1b檢測

研究表明，117份材料中，56份材料攜帶Rht-B1b基因，占47.9%，平均株高為87.3 cm，變異范圍為52～110 cm。只考慮在我國育種應用最廣的Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht-B1b基因而無Rht-D1b和Rht8基因的材料有21份，平均株高88.1 cm，變異范圍63～105 cm。表2,圖1

圖1 部分材料Rht-B1b基因檢測結果
Fig.1 Detection results ofRht-B1bgene

表2Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因及其組合株高
Table 2 Plant height traits ofRht-B1b,Rht-D1bandRht-8 dwarf genes

基因組成Genes材料(份)Cutivars(lines)平均株高(cm)Plant height變異范圍(cm)Variation rangeRht-B1b2188.163～105Rht-D1b882.565～100Rht81889.275～117Rht-B1b、Rht-D1b485.576～100Rht-B1b、Rht81690.774～110Rht-D1b、Rht81984.174～115Rht-B1b、Rht-D1b、Rht81583.274～98

2.2 矮稈基因Rht-D1b檢測

研究表明，117份材料中，46份材料攜帶Rht-D1b基因，占39.3%，平均株高為83.7 cm，變異范圍為52～115 cm。如只考慮Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht-D1b基因而無Rht-B1b和Rht8基因的材料有8份，平均株高82.5 cm，變異范圍65～100 cm。表2，圖2

圖2 部分材料Rht-D1b基因檢測
Fig.2 Detection results ofRht-D1bgene

2.3 矮稈基因Rht8的檢測結果

研究表明，117份材料中，68份材料攜帶Rht8基因，占58.1%，平均株高為86.8 cm，變異范圍為52～115 cm。只考慮Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因，在117份材料中，有Rht8基因而無Rht-B1b和Rht-D1b基因的材料有18份，平均株高89.2 cm，變異范圍75～117 cm。表2,圖3

圖3 部分材料Rht8基因檢測
Fig.3 Detection results ofRht8 gene

2.4 矮稈基因Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8的多組合檢測

一些小麥品種中Rht-D1b、Rht-D1b和Rht8三種矮稈基因組合出現，117份材料中，同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b基因的材料有4份，占3.4%，平均株高為85.5 cm，變異范圍為76～100 cm；同時攜帶Rht-B1b、Rht8基因的材料有16份，占13.7%，平均株高為90.7 cm，變異范圍為74～110 cm；同時攜帶Rht-D1b、Rht8基因的材料有19份，占16.2%，平均株高為84.1 cm，變異范圍為74～115 cm；同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因的材料有15份，占12.8%，平均株高為83.2 cm，變異范圍為74～98 cm。表2

2.5 矮稈基因Rht9和Rht13的檢測

試驗中檢測Rht9基因所用引物對為BARC151-F和BARC151-R，擴增片段長度為220 bp。研究表明,117份材料中，18份材料攜帶Rht9基因，占15.4%，平均株高為92.6 cm，變異范圍為65～117 cm。檢測Rht13基因所用引物對為WMS577-F和WMS577-R，擴增片段長度為130 bp。117份材料中，14份材料攜帶Rht13基因，占12.0%，平均株高為93.4 cm，變異范圍為82～117 cm。圖4～5,表3

圖4 部分材料Rht9基因檢測
Fig.4 Detection results ofRht9 gene

圖5 部分材料Rht13基因檢測
Fig.5 Detection results ofRht13 gene

2.6 117份小麥種質的矮稈基因分布頻率分析

研究表明，Rht-B1b、Rht-D1b、Rht8、Rht9和Rht13矮稈基因在不同小麥種質中的分布頻率不同，基因組合方式也不一樣。只含單個矮稈基因的分布頻率高低依次為：Rht-B1b(12，10.3%)>Rht8(13，11.1%)>Rht-D1b(5，4.3%)>Rht13(1，0.9%)>Rht9(0，0.0%)。117份種質中未發現Rht9基因單獨攜帶的情況，而以基因組合形式出現的有18份種質；單獨攜帶Rht13基因的情況也較少，只有1份種質，以基因組合形式出現的有14份種質。5個矮稈基因以同時攜帶2個基因的組合形式出現，占到37.8%，分布頻率高低依次為：Rht-D1b、Rht8(15，12.8%)>Rht-B1b、Rht8(12，10.3%)>Rht-B1b、Rht9(5，4.3%)>Rht-B1b、Rht-D1b(3，2.6%)=Rht8、Rht13(3，2.6%)>Rht-B1b、Rht13(2，1.7%)=Rht-D1b、Rht9(2，1.7%)>Rht-D1b、Rht13(1，0.9%)=Rht8、Rht9(1，0.9%)>Rht9、Rht13(0，0)。5個矮稈基因以同時攜帶3個基因及以上的組合形式出現，分布頻率為21.4%；其中以同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因種質最多，占到12.8%。另外，5種矮稈基因均不攜帶的種質有15份，占到12.8%。表3

表3 我國小麥主產區117份種質的矮稈基因類型及株高
Table 3 Dwarf gene types and plant height of 117 germplasms from main wheat production areas in China

材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height渦9703安徽--+-+95中育1401河南-++--77皖麥19安徽-+++-92中育1439河南+++--80農大189選北京----+110抗白781河南--+--86普冰201北京+--+-77豫展10號河南--+--75夏河銀白甘肅+----105花培1號河南-----82中植1號甘肅--+++11702中46河南-----79定8654甘肅+-++-10604中35河南-----80華糯1號廣東++---100溫8春河南-----90豐優7號貴州+----100濰麥9號河南-----82黔0205貴州+----75鶴034河南--++-105藁2018河北-+--+83百農金優32河南--+--90藁優9618河北+----72周麥26河南--+--84師灤02-1河北++--+87鄭麥379河南--+--81冀糯200河北+-+--91BNS-T1河南+++--52高碑店-1河北+-+--89襄麥29湖北+---+83藁優503河北+-+--95襄麥55湖北+----100高區乙6號河北+++--90漢北麥湖北-+++-87邯7050河北-----93小冰麥33吉林-----105河農604河北-----95生選4號江蘇+-+-+97邢1387河北-----98生選5號江蘇--+--82冀2003河北+--+-93南農04Y10江蘇+-+++103內麥9號河南++---79揚麥6號江蘇-----85鄭9023河南-+---86揚糯麥1號江蘇+--++90鄭農7號河南-++--87揚麥18江蘇--+--84鄭95515河南+----76徐麥31 江蘇+-++-82花培5號河南--+-+85白麥2577內蒙古+----98豫農6072河南+-+--74蒙阿石-1內蒙古-+-+-100周麥11河南+-+--85寧春38寧夏+--+-92周麥16河南-++--80山農優麥3號山東+----99豐德存1號河南+++--80煙農19山東+++--8304中36河南+-+--83濟麥26山東+++-+92中育885河南+++--85濟麥27山東+++--87中育1107河南-++--75濰麥7號山東+++--87中育9302河南+++--79優麥2號山東-++--115

續表3 我國小麥主產區117份種質的矮稈基因類型及株高
Table 3 Dwarf gene types and plant height of 117 germplasms from main wheat production areas in China

材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height材料名稱Cutivars(lines)來源SourceRht-B1bRht- D1bRht8Rht9Rht13株高Plant height中育9307河南+----76優麥3號山東+++--9605中27河南-+---90泰山149山東--+--100溫麥6號河南-++--79濰麥8號山東-----85矮早781河南+-+--85太原新冬山西--+--103偃師4110河南-++--88臨汾138山西+--++85天民矮早八A系河南-+++-74陜農981陜西+++--98蘭考198河南-++--75武功122-1-1陜西+----87漯麥16河南-----82小偃22-10純系陜西+-+--95內鄉188河南+++--81抗赤6號陜西+---+98洛麥23河南-++--79矮稈962早陜西+++--84洛麥29河南--+--92陜麥94-1-44陜西-++--75泛麥803河南+++--74B91043陜西+--+-89駐麥6號A河南-----81陜808陜西-+---86濟創28號河南++---76川育55871四川-----100內鄉201河南-+-+-65川麥107四川-++--100科育818河南-+---95川農19四川--+--80洑麥053河南-++--75川育40755四川--+--83中原008河南-++--75綿陽2000-13四川+-+--84新麥208河南-++--80川農21四川+----86新麥18河南-++--80川農23四川--+-+82平原50河南+-+--110新春9號新疆+--+-105百農矮抗58河南+-+--74云麥53云南+-+--98百農160河南+----63云南麥云南-+++-105荔矮4330-1河南-+---55中國春四川-----121中育1311河南--+--82

3 討 論

矮稈基因的利用有利于提高小麥的抗倒性和進一步挖掘其產量潛力。由于矮稈基因隱性類型的較多，在小麥育種中早代并不宜選擇，而結合分子標記檢測，可以明確矮稈基因的有無及類型，最終加快育種進程。

各矮稈基因的降稈能力各不相同，研究表明,攜帶Rht-B1b植株的降稈幅度達到24%，與分別攜帶Rht-D1b、Rht9、Rht13植株的降稈能力差異不大，而Rht-B1b與Rht-D1b組合會產生累加作用，降稈幅度能達到60%；攜帶Rht8的植株相對于它的高稈品種降稈11%左右，屬于弱降稈基因[21]。研究對國內小麥主產區的117份種質進行了矮稈基因分子檢測，結果表明，5個矮稈基因的降稈效應依次為：Rht-D1b>Rht-B1b>Rht8>Rht9>Rht13；就3種矮稈基因Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8的組合而言，其降稈效應依次為：Rht-B1b+Rht-D1b+Rht8>Rht-D1b+Rht8>Rht-B1b+Rht-D1b>Rht-B1b+Rht8；與之前其他學者的研究結果基本一致[22-23]。而在試驗中Rht-D1b+Rht8的降稈效應稍大于Rht-B1b+Rht-D1b，分析原因可能是受環境條件影響和小麥種質數量有限造成的。另外，對矮稈基因與株高進行t測驗的結果發現Rht-D1b與株高呈極顯著正相關，Rht9和Rht13與株高呈極顯著負相關，而在研究中Rht9與Rht13基本上都是與其他矮稈基因以組合的形式出現，由此原因可能是Rht9與Rht13與其他矮稈基因的組合產生了負向累加作用。

大多數矮稈基因具有一定的降稈作用，能夠提高抗倒伏和具有較高的肥水反應，但是存在一些缺陷，如矮稈基因與不利基因連鎖，影響小麥的抗病性、抗逆性、產量，熟期等；部分矮稈基因在農藝性狀上表現較差，利用價值有限。目前，生產上利用的品種，其攜帶矮稈基因多集中于Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因等少數類型，遺傳基礎狹窄，因此,尋找新的有應用潛力的矮稈基因十分必要。矮稈基因Rht13是一個部分隱性基因，對赤霉素GA3敏感，其主要通過縮短小麥莖節長度而降低株高，增加小麥產量；與Rht-D1b相比，不影響胚芽鞘的長度和幼苗生長活力，具有較大育種應用價值[24]。

4 結 論

研究對國內小麥主產區的部分品種進行了5個矮稈基因分子標記檢測，明確了這些品種所攜帶的矮稈基因。117份種質材料中，矮稈基因分布頻率依次為Rht8(68份，58.1%)>Rht-B1b(56份，47.9%)>Rht-D1b(46份，39.3%)>Rht9(18份，15.4%)>Rht13(14份，12.0%)。部分種質中同時攜帶2個矮稈基因的組合占到37.8%；同時攜帶3個及以上基因的組合占到21.4%，其中以同時攜帶Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8基因種質最多，占到12.8%。5種矮稈基因均不攜帶的種質有15份，占到12.8%。鑒定出14份攜帶Rht13矮稈基因的新種質。