花期短期低氮處理對黃瓜抗壞血酸及可溶性糖含量的影響

李云云，李 強，余宏軍，蔣衛杰

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜是我國保護地生產中栽培面積最大的蔬菜作物之一，其維生素、礦質元素及其他營養成分含量豐富，抗壞血酸（AsA）和可溶性糖含量是黃瓜果實重要的品質指標。研究表明，蔬菜的AsA和可溶性糖含量受到生物學特性、環境條件和施肥等因素影響，其中氮素營養供給是調控其含量變化的重要栽培措施之一。研究發現在菠菜［1］、生菜［2］、白菜［3］等葉菜類蔬菜中，不同氮素供給水平可以顯著影響蔬菜葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、有機酸、AsA等物質的含量，隨著氮素供給水平的提高，蔬菜風味品質明顯下降，可溶性糖、AsA含量并沒有隨著氮素供給的增加而增加，相反在低濃度氮素供給水平下，其可溶性糖和AsA含量提高，風味品質改善。劉玉梅等［4］研究發現，在黃瓜栽培中也有相同現象，氮肥過量施用會引起黃瓜果實風味品質下降（可溶性糖含量、可溶性固形物減少），低濃度氮素供給條件下，黃瓜幼苗葉片中可溶性糖含量和AsA含量增加［5-6］，但是低氮供給對黃瓜果實中可溶性糖和AsA含量的影響及其調控還鮮有報道。

本試驗通過營養液栽培方式對黃瓜進行短期低氮處理，探究黃瓜中AsA和可溶性糖含量的變化，希望為黃瓜栽培生產中合理使用氮肥，提高氮肥利用效率，改善果實品質提供有價值的理論依據和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗于2016年5～7月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所無土栽培課題組玻璃溫室內進行，所用材料為黃瓜“9930”（中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃瓜育種課題組提供）。2016年5月21日選取飽滿的黃瓜種子進行催芽，50℃溫水浸泡30 min，5%次氯酸鈉溶液遮光浸泡15 min，清水清洗3次后置于28℃恒溫培養箱中孵育約24 h，種子露白后在穴盤中進行育苗。黃瓜植株長至一葉一心時選取長勢一致的幼苗移植到29 cm×12.5 cm×7.5 cm的長方體水培槽中，每個水培槽中定植兩株黃瓜植株。其中營養液為改進的hoagland營養液，其中各營養元素組分及濃度如下：Ca2+4 mmol/L，NH+41 mmol/L，K+6 mmol/L，PO43-1 μmol/L，SO42-3.5 μ mol/L，Mg2+2 mmol/L，Fe3+79.01 μ mol/L，Mo6+0.11 μmol/L，Cu2+0.32 μmol/L，Zn2+0.77 μmol/L，Mn2+9.59 μ mol/L，B3+46.26 μ mol/L。配制營養液所需水均為蒸餾水，并調整營養液pH值為5.8～6.0，水培期間采用電動通氣泵裝置為植株進行間歇供氧。

試驗共分為3個處理，各處理的氮素供應濃度分別為 CK，12 mmol/L；T1，0 mmol/L；T2，3 mmol/L。除氮素濃度不一樣外，其他營養元素含量一致。在黃瓜植株雌花開放當天進行短期（7 d）不同營養液處理，并將雌花開花當天記為0 d，分別在處理的0、1、3、5、7 d對黃瓜植株的葉片和果實進行取樣和相關指標測定。其中，植株生長期間，每隔3 d更換一次營養液，處理之前將植株底部節位的根瓜摘除，取樣果實及葉片統一保持在第5～8節位之間，其他栽培管理技術同日常生產管理一致。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 黃瓜AsA的提取及測定

分別在處理的0、1、3、5、7 d取各處理植株葉片和果實，并用錫紙包裹后迅速置于液氮中，保存在超低溫冰箱中，用于AsA含量測定，其中AsA相關提取和測定方法參考Kampfenkel等［7］的方法，稍加改進。

AsA和總量抗壞血酸（T-AsA，包括抗壞血酸氧化型AsA和還原型DHA）的提?。簻蚀_稱取葉片樣品0.3～0.6 g，果實樣品1.0～3.0 g，加入6%（w/v）的預冷TCA溶液（含1 mmol/L的EDTA），在冰上研磨至勻漿，后定容至5 mL，于4℃下11 000 r/min離心20 min，收集上清液用于AsA和T-AsA 含量測定。

T-AsA含量測定反應體系：首先在離心管中加入0.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）和0.2 mL待測樣品上清液，然后依次加入0.2 mL 6 mmol/L的二硫蘇糖醇溶液（DTT，用0.2 mol/L的磷酸緩沖液配制，并含有3%冰醋酸，現用現配），42℃溫水浴15 min，取出后加入0.1 mL 0.5% 的N-ethylmaeimide溶液（NEM，用預冷的0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液配制），室溫靜置2 min，而后分別依次加入1 mL 10%的TCA，0.8 mL 42%的磷酸，0.8 mL 2%的2，2’-雙吡啶溶液（用70%乙醇配制溶液），0.4 mL 3% FeCl3溶液（現配現用），充分混勻后42℃水浴60 min，短暫離心后取上清液在525 nm波長處測定其吸光值，其中以0.2 mL磷酸緩沖液作為空白對照。根據T-AsA的標準曲線計算待測樣品中的T-AsA含量。

T-AsA濃度的計算公式為：A525=0.735 9×C（T-AsA）-0.027 3，R2=0.993 6。 其 中，A525代 表525 nm波長處的吸光值，C（T-AsA）代表樣品中T-AsA濃度。根據待測樣品鮮重，進一步計算樣品中T-AsA含量。

AsA含量測定反應體系：首先在離心管中加入0.8 mL 0.2 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH值7.4）和0.2 mL待測樣品上清液，然后依次分別加入1 mL 10%的TCA，0.8 mL 42%的磷酸，0.8 mL 2%的2，2’-雙吡啶（用70%乙醇配制溶液），0.4 mL 3%FeCl3溶液（現配現用），充分混勻后42℃水浴60 min，短暫離心后取上清液在525 nm波長處測定其吸光值，其中以0.2 mL磷酸緩沖液作為空白對照。根據AsA的標準曲線計算待測樣品中的AsA含量。

AsA 濃度：A525=0.837 2×C（AsA）-0.021 7，R2=0.996 8。其中，A525代表525 nm 波長處的吸光值，C（AsA）代表樣品中AsA濃度。根據待測樣品鮮重，進一步計算樣品中AsA含量。

DHA含量即為T-AsA與AsA含量差，并根據AsA和DHA含量計算樣品中氧化還原比率即AsA/DHA。

1.2.2 黃瓜可溶性糖的提取及測定

樣品中可溶性糖的提?。簻蚀_稱取葉片樣品3～5 g，果實樣品10 g，其中果實樣品置于研缽中冰上研磨至勻漿，葉片樣品中加入與樣品質量等比例（w∶v=1∶1）的滅菌ddH2O冰上研磨至勻漿，將勻漿樣品置于80℃熱水浴1 h，水浴后12 000 r/min離心20 min，然后收集上清液經0.22μ m的濾膜過濾后，上樣至高效液相色譜（HPLC）用于可溶性糖組成及含量測定。

樣品可溶性糖的測定方法及其色譜條件：每個樣品進樣體積為10 μ L，上樣至Waters 2695系列高效液相色譜儀（Waters，USA），儀器分別使用Enpower Pro工作站和Waters 2414示差折光監測器，色譜柱為Agilent Polaris 3 NH2（250×460 mm，3μ m），柱溫為25℃，檢測池溫度為35℃，流動相為乙腈∶水=80∶20（v∶v），流速保持1 mL/min。

可溶性糖標準品共測定7種可溶性糖（圖1），根據保留時間分別是木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖，實際樣品測定中共測出木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖4種糖，部分樣品測定出半乳糖，每個上樣樣品重復測定兩次，每個處理均有3個生物學重復，計算3次重復的平均值作為最后結果。

數據處理及結果分析采用SPSS 16.0軟件進行，采用DUNCAN法進行多重比較及差異顯著性分析，其中，*和**分別表示處理與對照之間的差異顯著性，即顯著和極顯著（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 7種可溶性糖高效液相色譜圖

2 結果與分析

2.1 短期低氮處理對黃瓜AsA含量的影響

短期低氮處理下，T1和T2黃瓜果實中的T-AsA和AsA含量均高于CK，但是隨著處理時間延長和果實膨大發育，T-AsA、AsA、DHA含量均呈現下降的趨勢（圖2）。T1果實中T-AsA含量在處理第3、5 d顯著高于CK，分別增加了16.4%和69.5%；T1和T2中 的AsA含 量 在 處 理 第1、3 d顯著增加，其中第1 d T1和T2分別增加21.2%和19.9%，第3 d T1和T2分別增加24%和19%；與CK相比，處理果實DHA含量在處理起始階段變化不大，與CK無顯著差異，但是在處理后第5 d兩處理果實中DHA含量均顯著高于CK，分別增加了112%和81.7%；此外，處理期間T1和T2果實中AsA/DHA隨著處理時間延長呈現下降趨勢，且在處理起始階段T1和T2的AsA/DHA略高于CK，但是隨著處理時間延長CK中AsA/DHA上升，可能是隨著低氮處理的持續，處理果實中AsA的氧化能力增強，被相關的氧化酶氧化為DHA，不能及時還原為AsA。

圖2 處理期黃瓜果實中AsA含量變化

與果實AsA含量變化不同，處理期間葉片中AsA含量保持平穩增加（圖3），這可能是因為結果期果實處于迅速膨大期和發育期，果實中水分含量增加明顯，而葉片作為光合組織不斷通過光合作用合成光合產物。在處理期間，處理葉片T-AsA含量均高于CK，T1在處理第5、7 d T-AsA含量顯著提高，分別增加22.4%和16.9%；而處理起始階段AsA含量則并無顯著差異，在第5 d T1葉片中AsA含量提高了20.7%，在第7 d T2葉片中AsA含量提高了10.4%。葉片中DHA含量變化與果實類似，在處理期表現出增多的趨勢，T1在處理第5、7 d比對照提高了24.6%和65.2%。葉片AsA/DHA變化與果實變化不同，其中T1葉片的AsA/DHA在處理期間呈現先上升后下降的趨勢，在處理第5 d達到最大值，在處理第7 d顯著低于T2和CK，而T2的AsA/DHA變化與CK的變化相似。

圖3 處理期黃瓜葉片中AsA含量變化

2.2 短期低氮處理對黃瓜可溶性糖含量的影響

短期低氮處理后，黃瓜果實和葉片中總的可溶性糖含量呈現先增加后減少的趨勢，且葉片中的可溶性糖含量遠高于果實。在果實和葉片中，總可溶性糖含量在處理第3 d迅速增加，分別比CK增加了1倍和27.6%，達到極顯著水平。在處理第5、7 d，果實和葉片中可溶性糖含量迅速回落，第7 d含量分別降至CK含量的50%和65%（圖 4）。

圖4 處理期黃瓜果實和葉片中可溶性糖含量變化

結果表明，黃瓜葉片和果實中最主要的可溶性糖為葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和半乳糖（圖5，圖6），其中葡萄糖和果糖是含量較多的兩種可溶性糖，是黃瓜中參與代謝和積累的主要糖，而半乳糖含量最少，甚至在黃瓜幼果期（雌花開花當天，處理第1 d）果實中沒有檢測到半乳糖（圖5）。隨著處理時間延長和果實膨大發育，處理果實中木糖含量明顯減少，葡萄糖和果糖在處理3 d之后含量顯著提高，果實中T1處理的葡萄糖和果糖含量均在處理第3 d達到最大值而后下降，T2與T1相比有一定滯后性，在處理第5 d含量最高。除此之外，處理果實中蔗糖含量無明顯變化，而CK果實蔗糖含量則一直增加；相反，半乳糖在處理果實中含量明顯增加，而CK果實中則無顯著積累。

圖5 處理期黃瓜果實中5種可溶性糖含量變化

黃瓜葉片中葡萄糖和果糖含量明顯高于其他可溶性糖（圖6）。處理期間葉片中木糖含量顯著降低，半乳糖、果糖和葡萄糖含量增加，在處理第3、5 d增加明顯；其中蔗糖含量變化與果實不同，果實中蔗糖含量較高，葉片中果糖含量明顯高于蔗糖，葉片在T1處理的3～5 d果糖含量增加明顯，T2中果糖含量與CK無顯著差異。

圖6 處理期黃瓜葉片中5種可溶性糖含量變化

3 討論

很多研究表明適宜濃度的氮素不僅有利于蔬菜［8］、作物［9］植株的生長發育，而且對提高果實產量、可溶性糖含量、蛋白質含量等品質改善及降低硝酸鹽積累有重要作用。研究發現氮素營養的供應與蔬菜作物體內可溶性糖、淀粉等碳水化合物及蛋白質、氨基酸等物質的合成積累有密切關聯。目前在黃瓜［4］、菠菜［1］、白菜［3］、生菜［2］等蔬菜作物中均發現供氮水平越高，可溶性糖越低，且在菠菜中發現過高和過低的氮素供應使得其葉片中AsA含量降低［1］。在本試驗中發現，短期低氮處理的3、5 d時處理黃瓜中T-AsA、AsA含量均高于CK；同樣在黃瓜葉片中T1處理第7 d DHA含量明顯高于T2和CK。處理黃瓜中T-AsA、AsA、DHA含量的變化說明短期低氮處理在一定程度上促進了葉片和果實中AsA含量的增加，這可能與AsA對植物逆境脅迫的響應有關。Shalata等［10］、Conklin等［11］、劉志禮等［12］、Zhang等［13］、孫娜等［14］研究發現在低鹽、臭氧、紫外線、低氮等環境脅迫下，番茄、擬南芥、黃瓜幼苗等葉片中AsA含量增加，提高了其植株對逆境脅迫的抗性。本試驗研究中短期低氮處理的黃瓜植株可能會以外界氮素營養供應水平的顯著降低（T1處理為完全氮脅迫，T2處理為低氮脅迫）作為信號來激活并調控其抗氧化物質（AsA），從而使黃瓜植株對低氮處理這一短期養分脅迫作出響應，但是隨著處理時間的持續，在后期T2處理葉片和果實中AsA/DHA提高，這說明在處理后期AsA的還原再生速率高于其氧化速率，促進了DHA的還原和AsA再生積累，因此維持了T-AsA含量的穩定甚至增多。

可溶性糖是綠色植物光合作用的重要產物，能夠參與植物體內諸多重要的代謝過程。在瓜果類蔬菜中，可溶性糖是果實生長發育的重要物質基礎，其組成和含量不僅影響了果實的風味和品質，而且可以作為上游底物和原料參加下游物質代謝與合成，同時也是細胞內的重要信號分子參與調節植物生長發育［15］。黃瓜果實中主要以水蘇糖和棉子糖作為轉運的光合產物，但是最終進入果實并參與代謝過程的是葡萄糖、果糖和蔗糖。吳樹玲［15］研究發現在黃瓜果實中主要是葡萄糖和果糖的積累，含量比蔗糖要高，沒有檢測到棉子糖和水蘇糖。在本試驗中，通過高效液相色譜法（HPLC）在黃瓜葉片和果實中共檢測到葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、半乳糖5種可溶性糖，其中含量較高的是葡萄糖和果糖，在CK植株中木糖含量也較高，而半乳糖含量最低，但在發育初期的幼嫩果實中沒有檢測到半乳糖，這與文獻報道結果相似［16］。此外，由植物AsA合成途徑可知，AsA合成的最上游底物是葡萄糖，而氮素供應水平可直接影響植物光合產物積累和碳氮代謝。已有研究表明，糖代謝為植物中的很多抗氧化物質合成提供了物質基礎和原料，其中葡萄糖供給使植物氧化還原能力增強，提高了植物抗性［17］。Smirnoff等［18］研究發現外源葡萄糖供給可以保持暗處理下植物葉片中AsA含量，Nishikawa等［19］研究結果表明外源蔗糖供給可以延緩采后花椰菜中AsA含量的損失，AsA含量增加；Loreti等［20］、Blokhina等［21］發現在缺氧脅迫下，外源糖供給能提高擬南芥幼苗對氧化脅迫的抗性，對植物起到保護作用。這些研究表明，可溶性糖不僅僅是植物碳水化合物的供給，同時也在植物遭受逆境脅迫時發揮重要作用。

4 結論

本試驗發現短期低氮處理黃瓜中葡萄糖、果糖、半乳糖含量提高，同時AsA含量增加?？扇苄蕴鞘茿sA合成的重要原料和中間底物，由此可知，處理黃瓜中糖含量的積累給下游AsA合成提供了物質基礎，因此黃瓜果實和葉片中可溶性糖含量和AsA含量均有所增加，這對通過有效使用氮肥來改善黃瓜果實的部分品質指標有一定的指導意義。